趾甲镰刀菌病真菌的扫描电镜观察和特殊制样方法 observation of fungi of toenail fusariosis by scanning electron microscopy and special sample preparation method.pdfVIP

第32卷第6期 电 子显微 学报 VoL32．No．6 2013年12月 ofChineseElectron 2013．12 Journal MicroscopySociety 文章编号：1000—6281(2013)06—0496—05 趾甲镰刀菌病真菌的扫描电镜观察和特殊制样方法 崔 芳1，胡丹丹2，黄攀登2，王丽H，林元珠2 (河北医科大学1．电镜实验中心，2．第四附属医院皮肤科，河北石家庄050000) 摘要：本文经反复摸索对比，总结出一套简便、完整、快捷的真菌扫描电镜(SEM)样品制备方法，并对分离培养 趾甲镰刀菌病的镰刀茵(Fusarium，F)进行了表面超微结构观察。在SEM下可清晰地分辨出真菌的菌丝和大、小分 生孢子。茵丝粗细均匀，形态饱满，表面有较规律且微微隆起的分隔，其上偶有分支，彼此连通。大、小分生孢子则 以孢尖或孢体依附贴合于菌丝上，其中大分生孢子较稀疏，呈镰刀形或纺锤形，两端较尖，孢体稍弯曲，背腹明显， 有2～5个环状竹节样膨隆，其中小分生孢子较密集，呈卵圆形或梨形，无或偶见一隔膜，且两种孢子均有顶端和侧 壁出芽。SEM观察结果为真菌的病原学分类和抗真菌药物筛选等方面提供了形态学依据。 关键词：扫描电镜；镰刀茵；真菌；样品制备 文献标识码：A 中图分类号：Q939．11；Q336 doi：10．3969／j．1000—6281．2013．06．008 据文献报道随着广谱抗生素、类固醇激素的大 1材料与方法 量应用，以及器官移植、介入疗法的不断开展，特别 是免疫缺陷疾病的增多，真菌感染的发病率明显增 样品来自河北医科大学第四医院皮肤科门诊男 多，并引起医学真菌界的关注。而早期快速确定致 性青年患者双足拇趾甲分离培养的镰刀菌。无菌条 病真菌类型，对临床诊断、治疗具有重要的指导作 件下刮取病变处的坏死组织，接种在葡萄糖琼脂培 用。然而真菌种类繁多，形态各异，且可能随环境变 养基上，置37℃温箱常规培养7天，逐日观察菌落 化而发生改变，致使真菌的分类鉴定具有一定的复 生长状态，然后切割适宜大小的培养基放在盖玻片 杂性。传统方法主要以形态学和生理生化鉴定为 上，挑取菌落转种于盖玻片与培养基的交界处，相同 主，即分离培养后在光镜下观察菌落形态结构以及 条件培养大约7～14天，待对数生长期病菌最为旺 各种生理生化特征。随着现代分子生物学技术迅猛 盛时，即可取材。SEM样品制备采用下列两种 方法： 发展，可以通过分析真菌18SrDNA和ITS核酸序 mm×3 列，从基因水平上分析各菌种之间的亲缘关系，使得 (1)用双面刀片从培养基上切取一块3 菌种鉴定更加准确、可靠，但形态学鉴定仍是真菌鉴 mm的真菌菌落，1％戊二醛固定20min，再用双蒸 水清洗2次，15rain／次；乙醇梯度脱水，浓度为 定的金标准。1’2J。扫描电镜(SEM)对观察研究真菌 表面超微形态也是一种重要的手段，但过去的SEM rnin／ 常规制备方法观察真菌，由于样品本身属单层细胞， 次；75％叔丁醇，100％叔丁醇各15min；置冰箱冷冻 其主要成分为真菌的孢子和菌丝，在制样过程中，极 室固化，抽真空升华干燥。 易变形，造成人工假象，很难达到满意