O型口蹄疫病毒3D基因荧光定量PCR方法的建立及应用.pdfVIP

• 34 • 生物技术 中国畜牧兽医 2014 年第 41 卷第 12 期 。型口蹄疫病毒 3D 基因荧光定量 PCR 方法 的建立及应用 曹丽捐l ，倪伟2 ，史慧君1 ，马世伟1 ，乔军I ，陈创夫1 O. 石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003 ;2. 石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003) 摘要:为建立快速检测抗 FMDV 转基因猪中 0 型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus. FMDV) 的荧光定量 PCR 方 FMDV 结构蛋白基因 3D 的核昔酸序列设计特异性引物，经过 RNA 抽提、反转录成 cDNA、 PCR 扩增，扩增出 法，本试验选择 了大小为 180 峙的基因片段。将回收的目的片段与 pMD18-T 克隆载体连接，转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞。提取的质粒 经 PCR、酶切和测序鉴定，证实为 FMDV 的阳性重组质粒。将验证正确的重组质粒 10 倍梯度稀释后作模板，进行荧光定量 PCR 试验，建立 FMDV3D 基因的标准曲线及其回归方程，并确定扩增的最佳退火温度。试验结果显示标准曲线的回归方程 为 Y=-3. 727X+32. 04. 回归系数 R =0. 980. 熔解曲线为单一峰。建立的荧光定量PCR 方法的灵敏度为1. 2X 101 L. 只 拷贝/严 与 FMDV 反应。结果表明，建立的荧光定量 PCR 方法具有特异性强、灵敏度高等特点，为检测 FMDV 在动物组织细胞中的 含量提供了技术方法。 关键词:口蹄疫病毒;荧光定量 PCR; 重组质粒;标准曲线 文章编号:1671-7236(2014)12-0034-06 中图分类号:Q78 文献标识码:A 口蹄疫(foot-and-mouth disease. FMD)是由口 监测每一轮 PCR 反应产物，并对与其产物量呈正相 蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus ,FMDV) 引 关的初始模板进行定量分析的技术(胡玉洋等， 2006) 。整个荧光定量分为相对定量和绝对定量 2 起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人畜共患 传染病。 FMDV 属于小 RNA 病毒科(Picornaviri 种。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中分子 dae) 口蹄疫病毒属(Aphthovir山)成员，有 7 个血清 数目，即通常所说的拷贝数。而相对定量的目的是 型，分别为 0、 A、 C、 Asial 和 SATl , SAT2 , SAT3 , 测定目的基因在 2 个或多个样本中含量的相对比 例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝 每一个血清型又可分为许多亚型。由于 FMDV 血 对定量的数据易于理解，且清楚明了，最后用建立出 清型多，遗传变异频率高，型间不能交叉保护，给 的标准曲线对未知样品进行定量分析(李慧峰等， FMD 的防制造成极大的困难。由于该病传染性极 2010; 袁元华等，2013) 。 强，对病畜和疑似感染动物必须紧急扑杀，对疫点周 本试验选择了 FMDV 中参与病毒复制的结构 围的广大地区须隔离封锁，禁止动物转运和畜产品