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O型口蹄疫病毒3D基因荧光定量PCR方法的建立及应用.pdf
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生物技术
中国畜牧兽医 2014 年第 41 卷第 12 期
。型口蹄疫病毒 3D 基因荧光定量 PCR 方法
的建立及应用
曹丽捐l ,倪伟2 ,史慧君1 ,马世伟1 ,乔军I ,陈创夫1
O. 石河子大学动物科技学院,新疆石河子 832003 ;2. 石河子大学生命科学学院,新疆石河子 832003)
摘要:为建立快速检测抗 FMDV 转基因猪中 0 型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus. FMDV) 的荧光定量 PCR 方
FMDV 结构蛋白基因 3D 的核昔酸序列设计特异性引物,经过 RNA 抽提、反转录成 cDNA、 PCR 扩增,扩增出
法,本试验选择
了大小为 180 峙的基因片段。将回收的目的片段与 pMD18-T 克隆载体连接,转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞。提取的质粒
经 PCR、酶切和测序鉴定,证实为 FMDV 的阳性重组质粒。将验证正确的重组质粒 10 倍梯度稀释后作模板,进行荧光定量
PCR 试验,建立 FMDV3D 基因的标准曲线及其回归方程,并确定扩增的最佳退火温度。试验结果显示标准曲线的回归方程
为 Y=-3. 727X+32. 04. 回归系数 R =0. 980. 熔解曲线为单一峰。建立的荧光定量PCR 方法的灵敏度为1. 2X 101 L. 只
拷贝/严
与 FMDV 反应。结果表明,建立的荧光定量 PCR 方法具有特异性强、灵敏度高等特点,为检测 FMDV 在动物组织细胞中的
含量提供了技术方法。
关键词:口蹄疫病毒;荧光定量 PCR; 重组质粒;标准曲线
文章编号:1671-7236(2014)12-0034-06
中图分类号:Q78
文献标识码:A
口蹄疫(foot-and-mouth disease. FMD)是由口
监测每一轮 PCR 反应产物,并对与其产物量呈正相
蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus ,FMDV) 引 关的初始模板进行定量分析的技术(胡玉洋等,
2006) 。整个荧光定量分为相对定量和绝对定量 2
起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人畜共患
传染病。 FMDV 属于小 RNA 病毒科(Picornaviri 种。绝对定量的目的是测定目的基因在样本中分子
dae) 口蹄疫病毒属(Aphthovir山)成员,有 7 个血清
数目,即通常所说的拷贝数。而相对定量的目的是
型,分别为 0、 A、 C、 Asial 和 SATl , SAT2 , SAT3 , 测定目的基因在 2 个或多个样本中含量的相对比
例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。绝
每一个血清型又可分为许多亚型。由于 FMDV 血
对定量的数据易于理解,且清楚明了,最后用建立出
清型多,遗传变异频率高,型间不能交叉保护,给
的标准曲线对未知样品进行定量分析(李慧峰等,
FMD 的防制造成极大的困难。由于该病传染性极
2010; 袁元华等,2013) 。
强,对病畜和疑似感染动物必须紧急扑杀,对疫点周
本试验选择了 FMDV 中参与病毒复制的结构
围的广大地区须隔离封锁,禁止动物转运和畜产品
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