PARP-1体外活性测定方法的建立及其应用.pdfVIP

.噩噩噩噩噩 PARP-l 体外活性测定方法的建立及其应用 陈蕴， 杨雪丽， 周海燕， 黄超， 王文龙， 龚笑海， 冯柏年， 金坚* (江南大学药学院.江苏元锡 2 14122) 摘要:建立 PARP-l 的体外活性测定方法并对 84 个具有潜在 PARP 抑制活性的化合物进行筛 选。 从 519 昆虫细胞中提取酶液，以 NADφ为底物，DNA 为激活剂，建立 PARP-l 的活性测定方 法;以高通量技术参数评价此方法，用已知 PARP 抑制剂进行验证，并以此方法进行PARP 抑制 剂的筛选。 结果显示，确定的酶促反应体系为: 12.5 nmol/L NAD +, 15μg/mL DNA ,6.25x lO-4 U PARP斗。 4乎价 Z 因子为 0.76 ， 5IB 值为 3.58。 基于此模型筛出 47 个化合物在浓度7.4 μmol/L 时 对 PARP-l 的抑制率达到 60%以上。 表明所建立的 PARP-l 活性测定方法，适用于 PARP-l 抑 制剂的高，通量筛选。 关键词:多聚二磷酸腺等核糖基聚合酶-1 ;活性测定;抑制剂;高通量筛选 中固分类号:Q 556.2;R 965 . 1 文献标志码:A 文章编号:1673一1689(2015)03--0324--06 Establishment and Application of Enzymatic Assay for Poly(ADP-Ribose) Polymerase-l CHEN Yun , YANG Xueli , ZHOU Hωyan ， HUANG Chα0 ， WANG Wenlong , GONG Xioohai , FENG Bαìnian ， JIN Jian. (Sch∞1 of Pharmaceutical Sciences. Jiangnan University. Wuxi 214122. China) Abstract: To establish an enzymatic assay for poly (ADP-ribose) polymerase- l and screen PARP inhibitors from 84 potentia1 compounds. Crude PARP-l w槌 extracted from S19 insect cells. With nicked DNA as activator ,PARP - l was used to catalyze the hydrolysis of the substrate NAD+ ,the RFU value measured from the remaining NADφwas used to eva1uate the activity of PARP-l or efficiency of PARP inhibitors. A 96 - microwell screening method was set up by optimizing the reaction system.The screening method w凶 assessed with high throughput index ,such 幽 Z factor , signal to back gr