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【资料】分子生物学常见问题解答 1、基因组DNA 的得率较低或者无基因组DNA 原因，如何解决？1) 样品材料老化或者反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或幼嫩的植物组织等，不能立即处理的样品应放入液氮或-70℃低温保存，以免DNA 降解。2) 样品破壁或者裂解不完全，DNA 未充分释放：动植物样品应在液氮中充分研磨，G+细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方法协助破壁。3) 样品过多导致细胞裂解不充分：加样过多导致细胞裂解不充分，细胞裂解不充分。4) DNA 吸附不均匀：如在上吸附柱前没有加无水乙醇，或使用低浓度乙醇代替无水乙醇，会导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶模吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量的无水乙醇，再上吸附柱使DNA 与硅胶模充分吸附。5) DNA 洗脱不适当：洗脱缓冲液pH 过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。洗脱液体积过少（30μl），不易浸透硅胶模，使DNA不能洗脱下来，因此洗脱液体积应大于30μl，超过200μl，所得的DNA 浓度降低。洗脱时可以将洗脱液于65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率，加大DNA 产量。2、基因组DNA 质量测定的问题分析。采用分光分度测定时OD260/OD280 比值1.8，说明大量RNA 残留，没有使用RNase A，或RNase A 活性下降。3、提取的基因组DNA 有降解，如何解决？选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液或不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或者低温保存的样品经反复冻融导致细胞破碎，内源性核酸酶降解DNA，因此应该选用新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中应该使用干冰。1) 未能有效的抑制内源性核酸酶的作用：某些DNase含量丰富的动植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过称中随时补充液氮，并在样品未完全解冻之前加入含有抑制核酸酶作用的裂解液。2) 操作过于剧烈导致DNA被机械打断：预处理的样品应该加入细胞裂解以后，所有操作应该尽量柔和，避免剧烈振荡。4、提取的基因组DNA 不能顺利的进行后继实验，如何解决？得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进行，主要原因为DNA 样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA 聚合酶的活性：1) 样品过多导致细胞裂解不充分：裂解液不能有效与样品混合，导致裂解不彻底，残留大量蛋白、多糖、脂类等杂质，为后继的上吸附柱分离纯化造成影响。2) DNA 洗脱前，有大量乙醇残留：有机溶剂乙醇可严重的抑制内切酶、DNA聚合酶的活性，而在DNA过柱洗涤过程中均使用含有乙醇的去蛋白液和漂洗液，因此在洗脱 DNA前，一定要充分去除残留的乙醇，再加洗脱液。5、提取的基因组DNA 有RNA 污染，如何解决？得到的基因组在进行常规下游实验如PCR、酶切、分子杂交等生物学实验时如不能顺利进行，主要因为DNA 样品不纯，含有蛋白、有机溶剂和盐类等杂质影响内切酶或DNA 聚合酶的活性。1) 实验过程中没有有效使用RNase A，应严格按照实验要求进行。2) RNase A 失活：RNase A 应该于-20℃下保存，低温保存时RNase A 比较稳定，不易失活，但是反复冻融会影响其活性。6、未提出质粒或质粒得率较低原因？1) 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。2) 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA 提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体 。3) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。4) 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分。5) 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。6) 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。7) 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。8) 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。9) 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris?Cl，pH 8.5) 或水。洗脱效率取决于pH 值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5 间。当用水洗脱时确保其pH值