于桉磁性复合微粒在mrna纯化中的应用(西北大学硕士学位答辩)2007.6.ppt

磁性复合微粒在mRNA纯化中的应用 专业：生物化学与分子生物学 答辩人： 于桉 导师： 崔亚丽 磁性复合微粒的概念及发展现状 mRNA纯化发展现状 内容提要 一 应用PG-Mag从总RNA中纯化mRNA 二 应用PG-Mag从组织中直接纯化mRNA初步 探索 三 应用链亲和素-金磁性微粒从总RNA中纯化mRNA初步探索 一 应用PG-Mag从总RNA中纯化mRNA （一） PG-Mag的制备及oligo(dT)20的偶联 （二） 应用PG-Mag从动植物组织总RNA中分离纯化mRNA (一) PG-Mag的制备及oligo(dT)20的偶联 oligo(dT)20 偶联步骤： 1 磁性微粒的预处理 2 向磁性复合微粒表面固定 oligo(dT)20 3 非特异性吸附的oligo(dT)20的清洗 4 封闭 5 非特异性吸附的封闭剂的清洗 反应条件的确定： 一 偶联条件的确立 1 oligo(dT)20偶联缓冲液的确定 2 oligo(dT)20偶联时间的确定 3 磁性复合微粒封闭条件的确定 oligo(dT)20偶联数量和mRNA提取质量的确定 4 磁性复合微粒偶联oligo(dT)20的数量 5 磁性复合微粒提取mRNA质量跟踪实验 1 oligo(dT)20 偶联缓冲液的确定 2 oligo(dT)20偶联时间的确定 3 磁性复合微粒封闭条件的确定 确立偶联体系： 偶联: 偶联缓冲液， 37? C， 180 rpm， 1h 封闭: 2%Lys 5%BSA ，37? C， 180rpm， 1h 保存: 0.01% DEPC 处理的偶联缓冲液 4 磁性复合微粒偶联oligo(dT)20的数量 5 磁性复合微粒提取mRNA质量跟踪实验 （二） 应用PG-Mag从动植物组织总RNA中分离纯化mRNA mRNA提取步骤： 1 动植物组织总RNA的提取 2 磁性微粒的预处理 3 杂交反应 4 非特异性吸附RNA的清洗 5 mRNA的洗脱 总RNA提取结果 动物组织mRNA纯化结果 植物组织mRNA纯化结果 纯化的mRNA质量验证： β-actin 核酸序列的反向扩增： 1 以oligo(dT)为通用引物进行mRNA到cDNA 的逆转录 合成。 2 以合成的cDNA为模板进行大鼠β-actin DNA 序列的合成 。 大鼠β-actin序列反向扩增结果 小结 应用偶联oligo(dT)20 的PG-Mag已经可以很好的从各种动、植物组织的总RNA中纯化mRNA，纯化出的mRNA能很好的应用于下游的分子生物学实验。 二 应用PG-Mag从动物组织中直接纯化mRNA 反应步骤： 1 液氮研磨动物组织 2 加入裂解液匀浆、裂解组织 3 离心匀浆液，弃去沉淀 4 预处理磁性微粒 5 将匀浆上清液加入磁性微粒，杂交反应 6 清洗非特异性吸附 7 洗脱mRNA 动物组织mRNA直接提取结果 小结 应用偶联oligo(dT)20的PG-Mag直接提取组织mRNA的方法，目前只成功纯化出大鼠肝脏组织的mRNA 。其它大鼠组织mRNA的提取含量偏低，不能通过电泳检测到，OD260/OD280的值低于1.8，有蛋白质的污染。 由于心脏和肾脏组织坚韧，不能对其细胞进行充分的裂解，而脾脏内含有较多的多糖。 三 链亲和素-金磁性微粒从总RNA中纯化mRNA初步探索 反应步骤： 1 动植物组织总RNA的提取 2 磁性微粒的预处理 3 杂交反应 4 非特异性吸附RNA的清洗 5 mRNA的洗脱  小结 在oligo(dT)的偶联量上，SA-Mag 少于PG-Mag，但由于生物素-亲和素系统的高特异性和亲和性，SA-Mag纯化出了更多量的mRNA。电泳结果表明，两者纯化的mRNA具有相同的质量。 因此，链亲和素－金磁性微粒比PDITC-磁性微粒能更好的应用于mRNA的分离纯化中，但链亲和素的高成本，制约了此载体的广泛使用。 致谢 衷心的感谢崔亚丽教授对我三年来的指导和帮助，她严谨缜密的思维、一丝不苟的工作作风深深感染了我，她的对我的严格要求和在学习工作中谆谆善诱让我终生难忘。 衷心的感谢陈超教授创立了国家微检测中心，让我们有了如此优良的实验平台，他睿智的思想和敏锐、深刻的洞察力极大的启发了我。