柚皮素滴眼液对光感受器细胞凋亡的防治作用及机制的分析研究.pdfVIP

中文摘要 目的： 柚皮素是一种具有多种眼科药理作用的黄酮类化合物，前期预实验发现1％柚皮 器细胞凋亡具有防治作用。因此，本课题进行1％柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究， 并进一步明确柚皮素滴眼液对MNU诱导大鼠光感受器细胞凋亡的防治作用，体外实 验以光损伤和H202诱导的小鼠视锥细胞(661W细胞株)损伤模型为研究对象，探讨 柚皮素对光感受器细胞凋亡的作用机制。 方法： (1)柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究：新西兰兔滴眼给予1％柚皮素滴眼液， 每眼1滴(50 gL)，在给药后的相应时间点采血，处死动物，摘眼球，分离眼球组 织，采用LC．MS／MS方法测定角膜、房水、玻璃体、视网膜以及血浆中柚皮素的浓 瞎 ￡又o (2)柚皮素滴眼液对MNU诱导的光感受器细胞凋亡的防治作用研究：单剂量腹 腔注射MNU建立大鼠光感受器细胞凋亡模型，大鼠双眼在造模前7天至造模后17 天分别滴眼给予溶剂滴眼液、O．5％和l％柚皮素滴眼液，一天三次，每次每眼一滴。 通过视觉电生理仪检查视网膜功能、水迷宫行为学试验以及HE染色组织病理学检查 综合评价柚皮素滴眼液对MNU诱导的大鼠光感受器细胞凋亡的作用。 胞株，通过光照8h建立661W细胞光损伤模型，造模后即刻加入0．5—100mg／L柚皮 素溶液孵育24h。通过MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧光酶 标仪检测细胞内ROS浓度。 661W细胞株，新鲜配制的5 H202与细胞孵育4h，换液，加入O．5．100 gmol／L mg／L 柚皮素溶液孵育24h。通过MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡率，荧 光酶标仪检测细胞内ROS浓度。 结果： (1)柚皮素滴眼液眼部药代动力学研究：建立了测定柚皮素的LC．MS／MS方法， 其方法学验证表明方法的灵敏度、专属性、准确度、精密度、线性以及回收率符合生 物样品分析方法验证的要求，适合用于柚皮素滴眼液的眼部药代动力学研究。参数 AUC(帆，显示，在角膜上柚皮素的暴露量最大，房水、视网膜以及玻璃体次之；柚皮 h达到67945．304-4109．34 325．694-239．34 60．524-38．78 ng／g、1 ng／mL、1 ng／mL和 1927．08+660．77 h。在Cm觚 ng／g；各眼部组织的半衰期分别为9．37、0．65、1．17和4．62 和Tm戤两个参数上可以看出血浆中总柚皮素与游离柚皮素浓度比较无统计学差异，总 柚皮素的Cm舣在给药后0．083h达到35．124-0．54 ng／mL。 (2)柚皮素滴眼液对MNU诱导的光感受器细胞凋亡的防治作用研究：视觉电生 鼠的振幅显著下降，潜伏期显著延长。与溶剂对照组比较，O．5％和1％柚皮素滴眼液 显著逆转MNU模型大鼠的振幅下降和潜伏期的延长。行为学水迷宫试验结果显示： 与溶剂对照组比较，0．5％和1％柚皮素滴眼液都能增加穿越次数(尸o．05)。视网膜 形态学结果显示柚皮素滴眼液能剂量依赖性地保护大鼠视网膜功能和结构。 (3)柚皮素对光诱导的661W细胞凋亡的防治作用机制研究：MTT法检测结果 显示100 mg／L柚皮素对正常培养状态下的细胞增殖无影响，溶剂对照组细胞存活率 显著降低，而1．100 mg／L柚皮素有促进光损伤细胞存活的作用。流式细胞术检测结果 显示溶剂对照组细胞的凋亡细胞显著增加，10 mg／L柚皮素有抑制光损伤细胞凋亡的 作用。荧光探针H2DCFDA检测结果显示，溶剂对照组细胞内ROS显著增加，10 mg／L 柚皮素具有逆转作用。 测结果显示溶剂对照组细胞的存活率显著降低，而5．100