重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备及其抑制新生血管活性的研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１２）：１２～１７ 重组人色素上皮细胞衍生因子融合蛋白的制备 及其抑制新生血管活性的研究 王亚妮　刘先宁　朱娟莉　安　娜　朱秀萍 （陕西省眼科研究所西安市第一医院　西安　７１０００２） 摘要　目的：人色素上皮细胞衍生因子 （ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍｄｅｒｉｖｅｄｆａｃｔｏｒ，ＰＥＤＦ）是一种有效的新生血 ? 管形成抑制因子和神经营养因子。通过原核细胞表达人ＰＥＤＦ蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活 性。方法：采用ＰＣＲ法扩增人ＰＥＤＦｃＤＮＡ，将其克隆到ｐＥＴ３２ａ载体中，在大肠杆菌ＢＬ２１中表达人 ＰＥＤＦ蛋白。经ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定后，镍柱亲和层析法变性条件下纯化重组融合蛋白。 ? Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测蛋白浓度，采用鸡胚脲囊膜法测其对新生血管形成的影响。结果：成功构建了ｐＥＴ３２ａ? ＰＥＤＦ表达载体。重组人ＰＥＤＦ蛋白在ＢＬ２１宿主菌中获得了稳定高效表达，鸡胚脲囊膜实验结果显示 在重组蛋白浓度为０．４、０．０４ｎｇ／ｍｌ时均有对新生血管的显著抑制作用（Ｐ＜０．０１），而在４ｎｇ／ｍｌ时无抑 制作用。结论：成功高效表达及纯化了重组人ＰＥＤＦ蛋白，鉴定其抑制新生血管的生物学活性，并且证 实该活性在一定范围内有效，为进一步研究其功能及推广应用奠定了基础。 关键词　人色素上皮细胞衍生因子　原核表达　新生血管 中图分类号　Ｑ７８ 　　眼部新生血管形成以及与其相伴的渗出、水肿、出 白，是一种有效的新生血管形成抑制因子和神经营养 血、大量炎性细胞浸润以及增生等一系列病理改变可 ［１］ 因子 。 严重破坏眼的结构和功能，导致患者视力障碍。因此， 近年来，通过实验研究发现其具有抗新生血管活 研究新生血管发病机制和能阻止其形成的抑制剂一直 ［２，３］ 性 。由于它能够选择性地抑制异常新生血管，因而 是国内外眼科学领域的热点和难点。眼部新生血管、 成为一种最具前景的新生血管生成抑制因子，逐渐应 特别是眼角膜及眼内新生血管发生的机制其学说众 ［４～６］ 用于眼科和肿瘤等领域 。然而，仅靠从视网膜色素 多，关系最密切的为缺血、缺氧。临床上常见的如各种 上皮细胞培养液中提取ＰＥＤＦ蛋白，来源受限，含量低， 原因的角膜新生血管，糖尿病视网膜病变，年龄相关性 使得这种蛋白的研究和使用受到了限制。本研究成功 黄斑变性，缺血性视网膜病变等以及早产儿视网膜病 构建了ｐＥＴ３２ａＰＥＤＦ原核表达载体，在大肠杆菌ＢＬ２１ ? 变均是目前世界的主要致盲眼病。这些病均是炎症浸 宿主菌中获得了稳定高效表达，并通过镍柱亲和层析 润，血管形成因子的产生，血管形成抑制因子的破坏以 得到了纯化的重组蛋白，鸡胚脲囊膜法鉴定其对新生 及这两种因子之间平衡的失调所致。 血管的影响，为进一步研究其在眼科领域的功能及推 　　人色素上皮细胞衍生因子（ｐｉｇｍｅｎｔｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ? 广应用奠定了基