冰核基因2拷贝串联重复细胞表面展示体系的构建.docVIP

冰核基因2拷贝串联重复细胞表面展示体系的构建 摘要：冰晶核蛋白（ice nucleation protein, INP）是存在于多种革兰氏阴性菌中的分泌型表面蛋白质，因其可作为细菌细胞表面展示系统的运载蛋白而引起研究者的兴趣。本研究主要利用来源于丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的冰晶核蛋白N末端结构域（InpN）作为运载蛋白，绿色荧光蛋白（GFP）为报告蛋白，在前期工作基础上，通过酶切、PCR等方法，构建能表达2拷贝InpN的大肠杆菌细胞表面展示重组质粒pTrcHisC-inpN-gfp，并在大肠杆菌受体菌JM109中表达。通过绿色荧光强度检测验证该重组质粒构建成功。该重组质粒的构建为进一步研究InpN的展示性能奠定了基础。关键词： 冰核基因、多拷贝、基因重组。8833 The construction of cell surface display system using tandem repeats of Ice nucleation protein Abstract: The ice nucleation protein (INP), a secretory protein from several Gram-negative bacteria, has drawn a wide intresting for development of the bacterial cell surface display system while used as a functional carrier protein. In this study, the N-domain of INP from Pseudomonas syringae was used as carrier protein and the green fluorescent protein (GFP) was used as passenger protein. Based on the previous work, a recombinant plasmid named pTrcHisC-(inpN)2-gfp, which contained two copies of inp-N gene, was constructed by PCR and restriction enzyme digest. Then the plamid was expressed in the Escherichia coli JM109. The recombinant plasmid was proved to be successfully constructed using the determination of fluorescence intensity. The construction of this recombinant plasmid can be used for the functional analysis of InpN as a carrier protein. Keywords: ice nucleation gene, multi-copy, gene recombination. 目录 1前言5 1.1冰核蛋白5 1.1.1冰核蛋白的结构特性5 1.1.2冰核蛋白的作用机制7 1.2 细菌细胞表面展示技术概述7 1.1.1　冰核蛋白的结构特性 细菌冰核蛋白INPs是由冰核基因( ina基因) 单独编码的。陆续克隆得到的ina 基因有ina Z、ina W、ina C、ina E、ina A、ina X、ina U、ina V 等基因，这些基因都是一些大小从3 600 bp 到4 000 bp 左右的开放读码框。基因序列分析结果表明，冰核蛋白基因序列的同源性为77%[2]。 根据冰核活性细菌( Ice nucleation active) 所具有的冰核活性的最高温度的差别, 将其产生的冰核活性蛋白分为三类[2]： Ⅰ型冰核活性蛋白( A 型或Type I)，在- 5～- 2℃就有冰核活性； Ⅱ型冰核活性蛋白( B 型或Type II)，在- 7～- 5℃条件下有冰核活性； Ⅲ型冰核活性蛋白( C 型或Type III) ，在- 10～- 7℃条件下有活性。 冰核细菌的冰核活性蛋白的一级结构是相似的，由三个完全独立的结构域组成[5]：N -端单一序列结构域，占整个序列的15%，该结构是相对疏水的； C-端单一序列结构域，占整个序列的4%，因富含酸性和碱性氨基酸残基而高度亲水；中间重复序列R-结构域占81% ，由冰核基因中间部分的相对保守的不完整的24 bp 周期性重复的DNA 序列GCCGGTTATG