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消癌平注射液体外作用于HEL细胞株实验探究【摘要】目的:探讨消癌平注射液对白血病细胞的抑制和凋亡作用。方法:以消癌平注射液处理JAK2突变的人红白血病HEL株,MTT法检测其对细胞的抑制作用,Armexin V/PI双染法检测细胞的凋亡程度。结果:高浓度的消癌平注射液(60ul/ml,70ul/ml,80ul/ml,90ul/ml),对HEL细胞均有抑制作用,且呈剂量依赖,经统计学分析有差异。消癌平注射液达到一定浓度时(50ul/ml,75ul/ml),未显示诱导细胞凋亡的作用,更高浓度(100ul/ml)导致细胞直接死亡。结论:高浓度的消癌平注射液对人红白血病HEL细胞有抑制作用,且呈量效关系。消癌平注射液对诱导HEL细胞凋亡无明显影响。? 【关键词】通关藤;细胞凋亡;抗肿瘤;流式细胞术;JAK2? doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.252文章编号:1006-1959(2010)-09-2506-02 Bcr-abl阴性的骨髓增殖性肿瘤(MPN)一直是临床治疗的难点,2005年JAK2 V617F点突变的发现使得人们对bcr-abl阴性的MPN的发病机制有了新的认识,分子机制的明确促进了MPN分子靶向抑制治疗的研究进程,多种JAK2抑制剂正在进行临床前研究,有些已经进入临床验证阶段,初步结果显示体内外均有抑制JAK2相关的信号途径的作用。但其研发成本及治疗费用均偏高,且其可预测副作用较大。因此,有必要寻求疗效好、毒副作用小的新的治疗方法和药物。而运用中药治疗恶性肿瘤,越来越被广大学者和患者接受,是恶性肿瘤综合治疗中的有效手段之一。? 通关藤,又称通光藤、乌骨藤,系萝摩科牛奶菜属植物通光散的藤茎,始载于《滇南本草》??[1]?,分布于云南和贵州,性味苦,微甘、凉,入肺胃膀胱经,具有抗癌、免疫调节、降压、戒毒作用及保肝利尿、恢复肿瘤患者放疗、化疗后白细胞下降等作用。“消癌平”为其成药商品名。本实验通过体外抗肿瘤实验方法观察了通关藤制剂-消癌平注射液,体外抗JAK2突变的人红白血病HEL细胞株活性,并应用细胞生物学及分子生物学技术探讨了消癌平注射液体外抗肿瘤作用的可能机制。? 1.材料与方法? 1.1材料:人红白血病HEL细胞,购自中国科学院细胞库。(经Real-time PCR检测,本细胞含有JAK2V617F纯合突变)。消癌平注射液(20mL/支):由南京圣和药业有限公司提供。四甲基偶氮唑蓝(MTT):上海生工生物工程有限公司。胎牛血清:GIBCO公司。RPMI-1640粉:GIBCO公司。凋亡检测试剂盒:BESTBIO公司。? 1.2方法:? 1.2.1细胞培养:HEL细胞悬浮生长于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,在37℃,体积分数为5%的CO??2?饱和湿度下培养。取状态良好、处于对数生长期HEL细胞进行实验。? 1.2.2MTT比色法检测细胞增殖:取待检细胞与培养液配成悬液,以每孔1×10??5?个细胞接种于96孔培养板中。实验组加消癌平注射液的培养液,使其最终浓度分别为10uL/mL,20uL/mL,30uL/mL,40uL/mL,50uL/mL,60uL/mL,70uL/mL,80uL/mL,90uL/mL,同时设不加药阴性对照和本底对照孔(不含细胞的等体积含相应浓度药物培养液),每组设5个复孔,每孔200uL。每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20uL 37℃继续孵育4h,离心,去上清。每孔加入150uL DMSO,振荡溶解30min。用自动酶标仪测定490nm波长下的吸光度(A),计算细胞增殖抑制率??[2]?。细胞生长抑制率=(对照组OD均值一实验组OD均值)/对照组OD均值×100%。? 1.2.3Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡:取对数生长期细胞,以每孔1×10??6?个/ml细胞接种于培养瓶。实验组加消癌平注射液的培养液,使其最终浓度分别为25uL/mL,50uL/mL,75uL/mL,100uL/mL,培养24h。离心,去上清,用PBS洗涤细胞两次。用400u1 1X Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×10??6?个/ml。在细胞悬浮液中加入5u1 Annexin V FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟。加入10ul PI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟。在1小时内用流式细胞仪检测。? 1.2.4统计学分析:应用统计软件SPSS11.0进行统计学处理,统计方法采用t检验和x??2?检验。? 以a=0.05作为检验水准。? 2.结果? 2.1对HEL细胞的抑制作用。不同浓度的消癌平注射液作用于体外培养的HEL细胞24