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粪便中小肠结肠炎耶尔森菌PCR检测方法建立[摘要] 小肠结肠炎耶尔森菌是一种人畜共患的病原菌。它在自然界中广泛分布,包括人、猪、牛等哺乳动物,禽类的排泄物,蜗牛等冷血动物,昆虫,未处理的冷水,污水,肉,乳制品,蛋制品,水产品和冰激凌。所致疾病主要有胃肠炎型和肠道外型。我科应用PCR方法检测小肠结肠炎耶尔森菌,及时发现患者和带菌者,为流行病学提供实验室依据,及时控制传染源,为预防疾病起重要作用。 [关键词] 小肠结肠炎耶尔森菌;PCR检测方法;病原菌 [中图分类号] R37[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(b)-023-03 小肠结肠炎耶尔森菌所致疾病在世界上广泛分布,但多集中在寒冷地区,在我国东北地区小肠结肠炎耶尔森菌各血清型的分布亦较广泛。本菌可感染人类以及多种动物,包括家畜、兽类、禽类、鸟类和昆虫,并通过排泄物和污染的水、食品传播。 1 实验方法 1.1 试剂 干燥培养基(北京陆桥生物技术有限公司);生物梅里埃API20E生化条;诊断血清。 1.2 仪器 美国BIO-PCR仪;Thermo生物安全柜;离心机。 1.3 样品采集 采集急性期、用药前采集患者新鲜粪便标本8例,每份2～5 g,放入Cary-Blair半固体保存培养基中,4℃冷藏运送至实验室。 1.4 操作 1.4.1 增菌 取1 g粪便接种于10 ml改良PBS培养基上,置于4℃冷增菌10～20 d。在冷增菌的第7、14、21天划线接种于耶尔森选择性平板、麦康凯平板,25℃培养24 h。增菌管内液体量较大,在接种前应轻轻混匀,再用接种环挑取液体,接种于预先准备好的上述平板,采取分区划线的方式,一般划3～4区,目的是划出单个菌落。由于总体菌量一般不大,每区划完后可不必烧灼接种环,直接划下一区即可。 1.4.2 培养 直接取粪便标本接种选择性平板(耶尔森选择性平板、麦康凯平板),25℃培养24 h。 1.4.3 鉴定 1.4.3.1 形态学鉴定在耶尔森选择性培养基上25℃培养24 h,形成较小的湿润菌落,直径为1～2 mm。中心呈深玫瑰红色,凸起较尖锐,周围有明显的透明环,称“公牛眼”。麦康凯平板25℃培养24 h,形成直径为0.5～1.0 mm的小菌落,菌落为圆形、光滑、湿润、扁平略有凸起、半透明,中央有极淡的粉色[1]。 1.4.3.2 生化鉴定从选择性培养基上挑取5个可疑菌落进行生化鉴定。 改良克氏双糖试验:挑取可疑菌落接种于改良克氏双糖斜面(用甘露醇取代乳糖),25℃培养24～48 h[2]。挑选斜边、底层均变为黄色(A/A)、不产H2S、不产气的菌株进一步鉴定。 尿素酶试验和动力观察:将改良克氏双糖上的可疑培养物接种到尿素培养基上,注意接种量要大,挑取一接种环,振摇数分钟,25℃培养2～4 h。然后将阳性者接种2管半固体,分别置于25℃和37℃温箱培养24 h,在25℃有动力者,进行镜检和进一步生化试验。 系统生化鉴定:可挑取上述可疑的菌落直接用API20E生化条进行系统生化鉴定,确定菌株种属。见表1。 表1菌株种属生化鉴别 血清学鉴定:使用致病性菌株常见血清型(我国一般为O∶3、O∶8、O∶9型)的特异性单克隆抗体进行玻片凝集,从而进行进一步鉴定和血清分型[3-4]。 PCR鉴定:毒力基因扩增,主要进行以下5个基因的PCR检测。 A.染色体源毒力基因 A1 ail:是黏附侵袭位点基因,介导小肠结肠炎耶尔森菌的侵袭性。 A2 ystA:是小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素A基因,编码致病性小肠结肠炎耶尔森菌分泌的一种耐热肠毒素,是小肠结肠炎耶尔森菌致泻的主要原因。 A3 ystB(主要为生物1A型小肠结肠炎耶尔森菌携带的):编码一种性质类似于ystA的耐热性肠毒素,ystB仅存在于生物1A型的菌株,而且在这个生物型中,目前证实这类菌株通常是非致病性菌株。研究报道此类菌株在腹泻患者中能够分离到。因此,这类菌株能否引起一些轻微的疾病有待进一步研究,它是否能够作为毒力决定因子,有待进一步研究。 B.质粒(pYV)源毒力基因 B1 yadA:黏附素,涉及自凝、血清抗性和黏附。 B2 virF:yop调节子的转录活化因子,yops调节蛋白,是致病所必须的。 C.其他有关基因的扩增 rfbC:该基因定位于rfb基因簇,O∶3血清型菌株特异性脂多糖O-侧链的生物合成。 D.PCR扩增程序 D1 DNA模板制备:一般检测使用水煮模板即可(如果进行分子生物学研究,可以使用试剂盒提取全基因组DNA,但成本较高),挑取平板上适量菌苔(200 μ