嗜热踝节菌脂肪酶TTL的重组表达及催化合成普瑞-生物加工过程.PDF

第 １４卷第５期 生　 物　 加　 工　 过　 程 Ｖｏｌ１４ Ｎｏ５ ２０１６年９月 ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｅｐ． ２０１６ － ｄｏｉ：１０３９６９／ ｊｉｓｓｎ１６７２ ３６７８２０１６０５００８ 嗜热踝节菌脂肪酶（ＴＴＬ）的重组表达及催化合成 普瑞巴林手性中间体 吴欣玮，郑仁朝，郑裕国 （浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 ３１００１４） 摘　 要：以催化合成普瑞巴林中间体（３Ｓ ） ２ 羧乙基 ３ 氰基 ５ 甲基己酸为目标，通过基因挖掘得到来源为嗜 热踝节菌的脂肪酶氨基酸序列，构建了基因工程菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１／ ｐＥＴ２８ｂ ＴＴＬ，在１６ ℃成功诱导表达了嗜 热踝节菌脂肪酶ＴＴＬ。 分离纯化得到ＴＴＬ 电泳纯酶，其最适反应温度为５０ ℃，在５０ ℃的半衰期为１４５ ｄ，表明 ＴＴＬ具有良好的热稳定性；ＴＴＬ 最适ｐＨ 为８０，在ｐＨ ７０～８５ 时稳定性好。 ＴＴＬ在５０ ℃、ｐＨ ８０ 条件下，催化 １００ ｍｍｏｌ／ Ｌ外消旋２ 羧乙基 ３ 氰基 ５ 甲基己酸乙酯水解转化率达４２％以上，产物的对映体过量值（ｅｅ．值）＞ ９４％。 这表明ＴＴＬ在化学 酶法合成普瑞巴林中具有较大应用潜力。 关键词：嗜热踝节菌；脂肪酶；低温表达；酶学性质；普瑞巴林 － － － 中图分类号：Ｑ９３６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ ３６７８（２０１６）０５ ００３７ ０８ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｌｉｐａｓｅ （ＴＴＬ） ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｅｇａｂａｌｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ＷＵ Ｘｉｎｗｅｉ，ＺＨＥＮＧ Ｒｅｎｃｈａｏ，ＺＨＥＮＧ Ｙｕｇｕｏ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００１４，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：（３Ｓ）⁃２⁃ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ⁃３⁃ｃｙａｎｏ⁃５⁃ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｏｆ ｐｒｅｇａｂａｌｉｎ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ，ａｎｏｖｅｌｌｉｐａｓｅ（ＴＴＬ）ｗａｓｅｘｐｌｏｉｔｅｄｆｒｏｍｇｅｎｏｍｅｏｆ Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ ｂｙ ｇｅｎｅｍｉｎｉｎｇｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ （３Ｓ）⁃２⁃ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ⁃３⁃ｃｙａｎｏ⁃５⁃ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ．ＴＴＬ ｗａｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ａｔ ｌｏｗ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ． ＴＴＬ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｔｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ．Ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ＴＴＬ ｅｘｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｔ ５０ ℃ ａｎｄ ｓｈｏｗｅｄ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ａ ｈａｌｆ⁃ｌｉｆｅｏｆ １４５ｄ．ＴＴＬｗａｓｓｔａｂｌｅｉｎｔｈｅｐＨｒａｎｇｅｆｒｏｍ７０ｔｏ８５ａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌ ｐＨｗａｓ ８０．Ｋｉｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ２⁃ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ⁃３⁃ｃｙａｎ