Bac-toBac杆状病毒昆虫表达系统介导重组腺相关病毒的制备.pdfVIP

摘要 目的：通过杆状病毒昆虫表达系统，实现临床级重组腺相关病毒(rAAV)的制各。 和HindlII双酶切，过胶纯化回收得到4806bp的日的片段，通过Klenow和T4Polymerase 平端化处理，用Solution I连接酶将两个片段连接到一起，构建成6859bp大小的顺式载 基因片段，因为pBcl I连接酶 将EGFP基因片段插入到pBcl 名为pBcl AAV 毒颗粒Bacmid，经PCR鉴定正确后，分别命名为Bacmid DNA后分别用转染试剂脂质 腓Cap／Rep。按照lnvitrogen质粒提取步骤提取Bacmid 达到约l AAV-EGFP和Bacmid 012v．g．／ml，用Bacmid AAV-Cap／Rep的P2病毒共感染昆 虫细胞sf9完成rAAV的拯救和包装过程。最后rAAV感染293T细胞来检测其活性。 AAV-MCS，将EGFP引入其多克隆位点，来检测该 酶切鉴定及测序正确，命名为pBcl AAV-EGFP；反式载体是利用真核基因遗漏扫捕 系统的可行性，测序正确后命名为pBcl 原理表达AAV的包装元件，其中衣壳蛋白是南同一mRNA、不同起始密码子和共I一的 衣壳蛋白和复制蛋白这两个基因表达片段经PCR反应连接到相应的限制性内切酶位点， AAV HindlIl和BamHI位点，经DNA测序正确后命名为pBclCap／Rep。此后将顺式载 具有良好的生物学活性。 结论：该系统克服了常规rAAV制备的限制性冈素，为临床级基因治疗用病毒的 制备提供了实验依据，为rAAV的基因治疗打下了良好的基础。 关键词：杆状病毒昆虫表达系统，sf9细胞，腺相关病毒，293T细胞 n ABSTRACT an andsafemethodfor ofrecombinantadeno。associated makeefficient production Objective：To insect clinicalscalebacuiovirus system． virus(rAAV)ofby expression terminal flameofrecombinant Methods：Inverted repeat(ITR)andtargetgeneexpression restrictionendonucleasePciIand adeno—associated were Sfol， virus(rAAV)vectordigestedby pAAV-MCS of were extractionthen the kit，and 2053bptargetfragments．Thetargetfra