不同碳源下毕赤酵母gs115蛋白组学分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（１）：２１２９ 不同碳源下毕赤酵母ＧＳ１１５蛋白组学分析  田小梅 　任建洪　房　聪 （苏州大学放射医学与公共卫生学院苏州普泰生物技术有限公司　苏州　２１５１２３） 摘要　毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系 统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支 原体污染问题；并能够对目的蛋白进行类似于高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化 等蛋白翻译后加工。但是不论是胞内表达或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问 题，这也是影响目的蛋白表达量的一个重要因素，同时还增加了纯化目的蛋白的难度。目的：研 究毕赤酵母ＧＳ１１５在不同碳源培养过程中胞内外蛋白质组学的差异，指导毕赤酵母表达系统的 优化。方法：利用ＬＣＥＳＩＭＳ／ＭＳ方法分析了不同碳源的四种培养基中毕赤酵母 ＧＳ１１５的胞内 和胞外蛋白种类，利用Ｇｒｉｆｆｉｎ等的计算方法计算各个蛋白的含量。结果：利用ＬＣＥＳＩＭＳ／ＭＳ结 合Ｇｒｉｆｆｉｎ等的归一化非标定量法ＳＩ得到ＧＳ１１５胞内胞外详尽的蛋白质种类及准确百分比含量。 Ｎ 结论：分析不同培养基之间蛋白质组成的差异，从而为以后构建新的毕赤酵母表达体系，为外源 蛋白表达系统的优化提供一定的指导意义。 关键词　毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５　不同碳源培养基　ＬＣＥＳＩＭＳ／ＭＳ　蛋白质组　表达 优化 中图分类号　Ｑ７８６ 　　酵母作为一种表达外源基因的宿主菌，既有原核 本身作用不大但与所要表达纯化的目的蛋白性质类似 生物操作简单，生长快的特点，同时还具有真核细胞的 的一些蛋白可以通过基因敲除的技术去掉，免去了纯 翻译后修饰功能。酵母表达系统一般有酿酒酵母系 化过程中要考虑如何将这两种性质类似的蛋白分开从 统，甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。 而得到目的蛋白的麻烦。 甲基营养型巴斯德毕赤酵母表达系统最为常用，并以 　　但目前并非所有外源蛋白都能在毕赤酵母中成功 ＧＳ１１５和ＫＭ７１酵母最为典型，因其自身分泌的背景蛋 高效表达。因为毕赤酵母本身的遗传背景会影响外源 白很少，糖基化程度低，对营养要求低，可采用廉价的 基因的转录、翻译、分泌通路等，酵母自身分泌的胞外 培养基，易于高密度发酵，也越来越受到研究者的 酶、细胞结合酶以及细胞裂解后释放的胞内酶等都可 关注。 能导致外源蛋白降解，最终导致不同的蛋白质出现表 　　利用毕赤酵母表达外源蛋白相对于原核表达系统 达水平、生物活性和稳定性的差异。目的蛋白的降解 有很多优势，特别是能够分泌到胞外的外源蛋白更是 问题备受关注，酵母液泡是降解蛋白的重要场所，酵母 简化了随后的纯化工作，但毕赤酵母自身胞内外存在 液泡中的各种蛋白酶随着发酵过程营养条件的改变发 的大量蛋白，为纯化过程增加了难度。本文分析了毕 生变化，如发酵过程中的饥饿胁迫、碳源改变、温度和 赤酵母ＧＳ１１５胞内外丰度较高的蛋白。详尽列出了含 ｐＨ变化及有毒有害产物的形成等。在毕赤酵母生长 量较高的前２０种蛋白的种类、含量及其特性，对于优 和表达外源蛋白过程中，碳源从葡萄糖或甘油到甲醇 化表达系统，简便纯化步骤具有重要意义。如对酵母 的改变，使得甲醇代谢酶系（ＡＯＸ，ＦＡＤ，ＤＨＡＳ等）和过 氧化氢体逐步积累，导致相应的蛋白酶产生［１］。Ｓｉｎｈａ 收稿日期：２０１１１０２６　　修回日期：２０１１１１０７ 电子信箱：ｃａｓａｂｌａｎｃａｔｘｍ＠１６３．ｃｏｍ