Rho激酶抑制剂Fasudil对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用的探究.pdfVIP

·中文论著摘要· 的保护作用的研究 刖 罱 视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia-rcpcrfusioninjury,RIR)是指各种原 因导致视网膜缺血一定时间，再次恢复血液供应后，视网膜组织的损伤进一步加 重的现象。RIR是眼科一种较为常见的病理过程，参与了多种疾病的发生，如青 光眼急性大发作、视网膜中央动脉阻塞、缺血性视神经病变、糖尿病视网膜病变 等。由于缺血缺氧引起视网膜神经元细胞的坏死、凋亡等严重损害，其组织学变 化的主要特点为视网膜神经细胞数目减少、视网膜萎缩变薄，最终严重损害视神 经的功能。长久以来，PAR的发病机制及临床治疗一直是眼科学研究的热点。 Rho激酶(Rho．-associated kinase coiled-coil-containingprotein ROCK)是丝氨 tightchain,MLC)磷酸化，调节细胞肌动蛋 激酶使其底物肌球蛋白轻链(Myosin 白骨架的重组，从而广泛参与细胞凋亡、细胞游走及浸润、细胞有丝分裂、肌肉 细胞收缩等一系列生物学过程。研究表明：Rho／Rho激酶通路参与了组织缺血再 表达增加，Fasudil还能够抑制炎性细胞游走、粘附、浸润等，并降低炎性细胞分 泌炎性因子，从而抑制局部的炎性反应，减轻损伤；阻断Rho／Rho激酶通路的激 活还可抑制细胞凋亡时胞膜小泡形成的形态学改变，具有抗细胞凋亡作用：阻断 Rho／Rho激酶通路具有神经保护作用，Fasudil可减轻谷氨酸诱导的神经元损害， 降低NMDA所致的神经毒性，促进神经细胞的存活。 视网膜缺血缺氧后，局部组织内促凋亡基因表达增强、iNOS等炎症因子表达 增加、NO及自由基等毒性产物增多、神经营养因子剥夺、中性粒细胞浸润，Ca2+ 超载、兴奋性氨基酸受体NMDA增多等因素对RIR的发病起到非常重要的作用。 根据目前发现的阻断Rho／Rho激酶通路后所产生的抗炎、抗凋亡及神经保护作用， 本实验拟采用急性升高眼压的方法制作大鼠RIR模型，通过玻璃体腔注射Rho激 形态学的改变，并用TUNEL方法检测Fasudil治疗前后视网膜细胞凋亡的改变， 来判断Fasudil对RIR是否有保护作用。 视网膜缺血再灌注损伤后，有多种凋亡相关基因表达异常，如Caspases-3， 白酶级联反应的必经之路： Bcl-2是一个抗凋亡基因，它通过与一些促凋亡基因 结合来实现其抗凋亡作用，而Bax则起到促凋亡作用。本实验用WesternBlot方 PCR方法检测 法检测Fasudil治疗前后Caspase．3蛋白表达的变化，用Real-time Fasudil治疗前后凋亡相关基因Bcl．2mRNA及BaxmRNA的表达变化，探讨 ． Fasudil对RIR大鼠视网膜细胞的抗凋亡作用。 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与RIR的关系十分密切，在视网膜缺血再灌注损 伤后，由于受到各种内外因子的刺激，视网膜内iNOS表达增加，iNOS被激活后 释放大量的NO，NO经过复杂的机制引起视网膜损伤。本实验用免疫组化、Western Blot及Real-time 膜缺血性疾病的治疗提供理论依据。 实验方法 l、将大鼠随机分为正常组、视网膜缺血再灌注损伤组、生理盐水对照组、 何处理因素；缺血再灌注损伤组只制作动物模型；对照组和治疗组采用玻璃体腔 眼内最终浓度为10州或30pM)4ul。给药5分钟后，采用急性升高眼压方法建 立RIR模型。 2、于缺血再灌注损伤后24小时和168小时处死各组动物，摘除眼球制作4pm 厚石蜡切片，HE染色光镜下观察损伤后24小时和168小时各组大鼠视网膜组织 病理学变化及视网膜厚度变化；末端脱氧核酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口 2 末端标记法(nn虹I，)检测损伤后24小时各组大鼠视网膜细胞凋亡情况，计算凋