Robo2调控小鼠肾脏及输尿管发育的研究.pdfVIP

中文摘要 Rob02调控小鼠肾脏和输尿管发育的研究 中文摘要 背景： 肾脏的发育是一个复杂过程，需要输尿管芽(UB)和后肾间充质(MM) 两种细胞群精确的相互作用来完成的。某一环节出现错误会导致肾脏发育不良、 膀胱输尿管反流等严重的肾脏和尿道发育异常。Rob02通过其配体Slit2在肾脏 发育过程中发挥重要作用。Rob02／Slit2基因缺失可以导致调节肾脏发育的主要 因素Gdnf的表达异常，从而使肾脏和输尿管发育异常，引起多个肾脏、多个输 尿管和输尿管扩张改变。但是目前对于Rob02调控’肾脏和输尿管发育的研究仍 比较缺少，主要是对肾脏发育初期Rob02／Slit2基因敲除导致输尿管芽萌出异常 的研究，缺乏Rob02对肾脏发育后期的影响以及Rob02基因缺失导致肾脏和输 尿管发育异常的机制研究。 目的： 通过观察和分析Rob02在肾脏发育过程中的表达变化、体外过表达Rob02 对肾脏发育的影响、Rob02基因敲除对小鼠肾脏和输尿管发育的影响等现象， 揭示Rob02在肾脏和输尿管发育过程中的作用及其机制。 方法： 色系统观察小鼠’肾脏发育各阶段的形态学变化特点；应用实时定量RT-PCR技 术对肾脏组织中Rob02 mRNA水平表达进行半相对定量分析；应用免疫荧光技 术检N4,鼠肾脏发育过程中Rob02蛋白水平的表达部位。 (2)显微分离胚龄E12．5d小鼠胚胎肾组织，应用显微注射及电转染方法， 进行表达载体显微注射、转染。实验分为三组，正常对照组、空载体组、转染 中文摘要 亡(PH3、TUNEL)免疫荧光染色，观察输尿管芽分支、肾小球数目及后肾间 充质细胞增殖、凋亡变化情况。 (3)取野生型胚龄E13．5d和E14．5d小鼠胚胎输尿管膀胱组织，应用免疫 的表达情况；应用组织PAS染色和免疫荧光染色的方法，观察Rob02基因敲除 小鼠胚胎肾脏和输尿管发育异常的情况。 (4)取野生型胚龄E12．5d小鼠胚胎肾脏、输尿管和膀胱组织，分别进行分 离培养，分为正常培养组、去肾组、去膀胱组和去肾去膀胱组，共4组，每组 1 荧光染色，观察各组输尿管长度的变化情况；并且应用显微注射和电转染的方 培养6天后进行E．cadherin和0【．SMA免疫荧光染色，观察输尿管长度的变化情 况。 3．5d (5)取同窝E1Rob02基因敲除野生型和纯合子胚胎，冰冻包埋连续切 片，TUNEL染色观察CND(common nephricduct)凋亡情况。 结果： (1)’肾脏发育过程中不同时间点的形态特征：①小鼠肾脏发育各阶段PAS 染色结果显示，UB于E11．5d开始分支，E15．5d可见到初步形成的肾盂、肾盏； E16．5d有发育成熟的集合管、肾盂、肾盏；②MM在整个后肾发育阶段围绕UB 出现肾小囊腔；E15．5d出现发育成熟的肾小球；E16．5d可见发育成熟的肾单位 (肾小球、近端小管、远端小管等)；出生后1．5d至1w肾小球数目继续增多； 出生后2w肾脏发育成熟。 (2)肾脏发育过程中Rob02的表达变化：①实时定量RT-PCR结果显示， 维持在低水平表达。②免疫荧光染色结果显示，Rob02最初表达在胚肾的后肾间 充质，而不在输尿管芽表达。随着胚胎肾脏发育，Rob02表达于后肾间充质细 胞膜、围绕输尿管芽的浓缩帽状间充质、逗号形体和“S”形体以及毛细血管袢， 最终表达于肾小球足细胞。另外，部分早期肾小管上皮细胞也有微弱Rob02表 达。 II 中文摘要 小球标志物WTl免疫荧光染色显示，正常对照组、转染空载体组肾脏输尿管芽 分枝和肾小球数目无明显异常；而转染GFP．Rob02组的输尿管芽分枝减少，肾 小球数目减少(po．05)。②与对照组相比，过表达Rob02组出现后肾间充质减 少，输尿管芽顶端缺少聚集的帽状间充质。③与正常对照组和转染空载体组比 较，过表达Rob02组肾脏后肾间充质细胞凋亡情况未见明显异常(po．05)，并 且E．cadherin染色显示输尿管芽上皮细胞形态及排列无异常。