S100A4及MMP-9在喉鳞癌中的表达及相关性研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 吾旨耆 莉 置 喉癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，在我国，东北地区是喉癌的高 发区。过去的10年中，我国喉癌的发病率呈现上升的趋势。喉癌对放疗及化疗均 不敏感，手术是目前治疗的主要手段，但其局部浸润和转移对临床治疗和预后有 着重要影响，是造成喉癌患者治疗失败和死亡的主要原因，而肿瘤侵袭和转移是 一个多步骤、多阶段、多途径、涉及多基因变化的一系列复杂过程，包括肿瘤细 胞从原发灶脱落，与基底膜粘着，产生蛋白酶降解细胞外基质，侵入血管或淋巴 管，诱导肿瘤血管形成，最终在远处形成转移灶。因此探讨与喉癌转移相关的基 因对喉癌的治疗和预后具有重要意义。 $100家族蛋白属于钙离子结合蛋白，在分子结构具有高度同源性，它们有共 同的EF双螺旋结构的氨基酸基序(手型钙离子结合区)，这一基序能够促进其与 钙离子高度结合，参与信号转导通路从而调节细胞的生长和分化。作为$100蛋白 家族成员，S100A4蛋白通过与钙离子结合在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。人 S100A4参与调节多种细胞内外功能，如细胞生长和新陈代谢，影响细胞骨架形成、 改变细胞形状、参与信号传导，调节细胞黏附等。S100A4可作为一种重要的肿瘤 调节因子发挥生物学作用，并且与肿瘤细胞侵袭和转移密切相关。研究报道在多 种肿瘤组织中$100A4表达升高，如食管癌、胃癌、结肠癌及黑色素瘤等，近来 研究发现在乳腺癌中上调$100A4的表达后促进肿瘤细胞转移，而且S100A4阳性 表达的乳腺癌患者预后很差。但S100A4参与肿瘤发生和转移的机制仍不十分清 楚。基质金属蛋白酶类(Matrix 链内切酶，MMPs激活后能够促进肿瘤生长，侵袭和转移，其家族包括21种以上 的蛋白酶。其中，MMP．9作为一种92KDA的明胶酶，于1989年首次从人纤维母 细胞克隆出来，人MMP．9基因位于染色体20q11．1．13．1。当它激活后能够使胶原 蛋白结构发生变形并将其降解，它通过降解细胞外基质和基底膜，从而促进肿瘤 侵袭和转移。在正常肺组织中MMP．9极少表达，但是在肺部疾病，如哮喘，肺纤 维化，COPD中高表达，亦有研究发现在乳腺癌，结直肠腺瘤和胃癌中MMP．9 的表达均比相应的正常组织中增高。它也是作为一种肿瘤促进因子发挥生物学功 能。 最近有研究发现在前列腺癌PC3细胞系中转染$100A4的表达载体后能够在 蛋白水平和mRNA水平上上调MMP．9的表达。所以我们推测在喉癌中$100A4 可能调节MMP．9的表达。两者可能在喉的发生发展及淋巴结转移过程中起协同作 用。但上述假设是否成立?其具体机制如何?这些问题需要我们进一步研究证实。 本研究目的旨在探讨喉组织中S100A4和MMP．9的表达情况及与临床病理学参数 的意义。在细胞水平上，通过干扰S100A4，观察其对MMP．9表达的影响。 材料与方法 一、材料 115例喉组织标本(35例癌旁喉组织和80例喉鳞癌组织)，均来自中国医科 大学附属第一临床学院2009．2011年耳鼻咽喉头颈外科手术切除的标本，所有患 者均为原发，术前均未接受放、化疗。标本经HE常规染色后由两名病理医师明 确诊断。其中部分癌旁喉组织(远离肿瘤至少1厘米)和癌组织离体后立即放入 液氮后．70。C冰箱保存，以备Westernblot检测。 5％C02的条件下培养。 =、主要试剂和来源 S100A4兔单克隆抗体，$100A4siRNA，MMP．9羊单克隆抗体均购自美国 Santa DAB酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。 三、方法 l、免疫组织化学染色及结果判定 2 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4pm连续切片，采用链菌素 抗生物素蛋白．过氧化物酶免疫组化法(S．P法)检测S100A4和MMP．9蛋白表达。 以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。结果判定：S100A4和MMP．9蛋白以细胞 质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。高倍视野(x400)下选阳性信号最强区域计数 200个肿瘤细胞中阳性细胞数，按S100A4和MMP．9蛋白表达百分率分为以下四 强度分为三个等级：浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。以阳 性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分4者判定为阴性，积分 4为阳性。