冬凌草甲素对小鼠急性肝损伤保护作用的研究和Keap1第四外显子突变位点的筛查.pdfVIP

摘 要 摘 要 摘摘 要要 背景 背景 背背景景 Nrf2/Keap1信号通路对于细胞抵御外来有害氧化应激刺激非常重要。Nrf2 是细胞 核转录因子，控制表达和协调诱导一系列编码去毒酶和抗氧化蛋白的防御基因。在内环 境稳态下，Nrf2 在胞浆中与其抑制因子Keap1结合，处于功能抑制状态。当细胞受到 氧化应激刺激时，Nrf2从Keap1中脱离并以稳定状态进入细胞核内，与未知蛋白质结 合为异二聚体，并与ARE 即抗氧化反应元件相结合促进其下游基因的转录和表达，对 细胞和组织起到保护作用。我们经研究发现冬凌草甲素不但可以启动Nrf2下游基因的 转录，并对小鼠急性肝损伤有保护作用。 正常情况下Keap1可将Nrf2 带入泛素通路而对其进行降解，当Keap1发生基因突 变时将无法降解Nrf2，从而导致Nrf2 在细胞核内的聚集。有研究表明，在肺癌、乳腺 癌及膀胱癌中有因Keap1突变使其功能的失活无法降解Nrf2，导致新陈代谢酶的活化 及抗药性的产生。越来越多的实验证据表明在几种肿瘤中因为先天的或后天的机制使 Nrf2 持续性激活，而使肿瘤得以生存及分化。最初的报道揭示在H1184 和H1648 肺癌 Keap1 Nrf2 54 细胞系中 的错义突变导致抑制 功能的丧失。随后，在 例非小细胞肺癌中 及12例细胞系中分别确定出10例和6例Keap1的错义突变、插入和缺失。重要的是报 道这些突变导致了Nrf2的持续激活。而且Keap1的突变经常伴随基因座的杂合缺失， 说明在非小细胞肺癌中Keap1的等位基因的缺失很常见。后来更多的Keap1的突变被 确定，其中腺癌29例中有3例，大细胞癌2例中有1例，小细胞肺癌8例中有1例。 有项研究表明在人Q293乳腺癌细胞系中包含一个失活的Keap1蛋白。在胆道肿瘤病人 中也发现有突变，13例胆囊癌病人中有4例发现有Keap1突变。这些结果说明Keap1 因突变导致的失活除了在肺癌中发生，也存在其他肿瘤中。我们通过对人食管癌Keap1 第四外显子的扩增及测序，发现一个同义突变位点。此同义突变位点可能对Keap1的功 能没有影响，但其他外显子中有无突变目前尚无报道。 I 目的 目的 目目的的 验证Nrf2/Keap1 信号通路对于急性肝损伤有至关重要的保护作用。并通过对食管 癌Keap1第四外显子的突变位点的检测，来证实Keap1基因突变是否存在于食管癌中。 方法 方法 方方法法 将C57BL/6小鼠40只随机分为四组：对照组、低剂量冬凌草甲素组、中剂量冬凌 草甲素组、大剂量冬凌草甲素组，构建不同保护模型。通过经胃给予对照组C57BL/6 小鼠0.05ml PEG400、后三组给予灌注相同浓度（400μg/mL）不同剂量冬凌草甲素（分 别为1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg）4周后，再共同灌注56度红星二锅头(0.1ml/10g)1 周 后处死取材，检测小鼠肝功AST、ALT水平是否有差异；并取小鼠肝脏行HE 染色，光 镜下观察肝脏病理变化，了解肝脏损伤情况。另外取36例人食管癌组织及癌旁组织提 DNA Keap1 4 取基因组 ，并以此为模板扩增 第 外显子。得到目的片段后，经过纯化后 直接行序列测定并与正常序列比对，查找基因突变位点。 结果 结果 结结果果 冬凌草甲素能通过Nrf2/Keap1信号通路，降低酒精对小鼠肝脏的损伤。人食管癌 Keap1的第四外显子中发现一个同义突变位点。 结论 结论 结结论论 冬凌草甲素通过激活Nrf2 转录因子，减轻有害物质如酒精对小鼠肝脏造成的急性 损伤；食管癌Keap1的第四外显子中发现一个同义突变位点，未能发现错义突变，无法 说明Nrf2/Keap1通路的异常可能也存在于食管癌中，需要进一步证实。 关键词 关键词 关关键键词词：Nrf2，Keap1，冬凌草甲素,食管癌 II