淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(ABAD)基因缺陷对小鼠脑和SK细胞线粒体功能的影响.pdfVIP

复旦大学博士论文 淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(BAD)基因缺陷变对小鼠脑及SK 细胞线粒体功能的影响 摘 要 阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统变性疾病，以进行性多项认知损害为主 要表现的综合征。患者脑中三大病理特征为淀粉样蛋白(AB)沉积、神经纤维 缠结及神经元丢失。近年来细胞内AB、线粒体功能紊乱在AD发病中的作用己 成为研究热点。 淀粉样蛋白结合醇脱氢酶(BAD)位于线粒体基质，催化醛、酮、醇及类固 醇等的氧化或还原。AB存在时，AB可与BAD结合，使后者构象改变，引起细 胞内氧化应激可致细胞死亡。而无AB环境下，ABAD在应激情况下对机体有保护 作用。 为更好研究ABAD与AB结合后在AD发病中的作用及ABAD本身的生理作用， 建立ABAD基因敲除小鼠模型是一研究基础。目前已成功新建立神经元内选择性 BAD基因敲除小鼠模型。本实验对该小鼠一般性状、特征，及线粒体功能，且 对于引起人类MHBDD疾病的BAD三个突变位点进行了初步的研究，为BAD在线 粒体内的功能提供一些线索。 第一部分选择性BAD基因敲除对小鼠神经细胞及其线粒体功能影响的初步 研究 目的：选择性神经元内ABAD基因敲除小鼠(ABADko小鼠)是新建立的小 鼠模型，需要明确其基本特征及神经细胞线粒体功能。探索神经元内BAD表达 量下降导致线粒体功能紊乱的可能原因。 方法：使用CREBPCR及FLOXPCR鉴定BADko小鼠基因型。使用western blot及免疫荧光染色鉴定ABAD在其大脑皮层及海马表达量。TMRM荧光染色了解 线粒体膜电位变化，MitoSOX荧光染色观察线粒体氧自由基的释放，用ATP试剂 盒测定脑组织ATP含量，TUNEL试剂盒染色观察神经细胞凋亡情况。免疫荧光染 色及Western 对Westernblot条带及荧光染色进行量化，通过标准曲线换算ATP脑组织含量， t 对TUNEL阳性的细胞及神经元进行计数等，用studenttest比较基因敲除小 鼠与对照小鼠的差异。 复旦大学博士论文 Aneo。Western 结果：ABADko小鼠基因型为CREB(+)且FLOX Blot结果提 示ABADko小鼠皮层及海马ABAD的表达量明显下降，密度值分别为皮层 O．81+0．129 VS．1．00+0．160， VS．0．29+_0．031，P=O．00098，海马1．74+0．144 P=O．01894。免疫荧光染色提示ABADko小鼠上述部位ABAD表达量下降。MHB染 VS． 色发现ABADko小鼠皮层MBB较wt小鼠明显增多，密度值为11．14+-0．609 6．92+-0．354，P=O．018，海马中ABADko小鼠MHB密度值较wt小鼠高，但P=O．48， VS． 无统计学差异。ABADko小鼠内嗅皮层中TMRM染色明显减低(1．00±0．081 在ABADko小鼠内嗅皮层中明显升高(1．00±O．062VS．1．37±0．085，P=O．004)， 而在运动感觉皮层无统计学差异(P=0．336)。脑组织ATP含量测定ABADko小鼠 数值相对低，但两组小鼠无统计学差异，可能取脑时间及部位不同影响结果(wt 小鼠脑ATP含量2．54±0．282，ABAD TUNEL染色发现7—8月ABADko小鼠皮层及海马均有TUNEL阳性细胞，较对照组 明显升高，且内嗅皮层区神经元与总神经细胞比值明显下降，提示有神经元丢失 (ABAD 0．050，P=0．032)，而3-5个月的ABADko及wt小鼠大脑皮层或海马中均无TUNEL 阳性染色，且皮层运动感觉区及内嗅皮层均无明显神经元