CaCl2浓度对感受态细胞转化效率的影响.PDFVIP

维普资讯 第26卷 湖北师范学院学报(自然科学版) V0I．26 第3期 JournalofHubeiNormalUniversity(NaturalScience) No．3，2006 CaC12浓度对感受态细胞转化效率的影响 王友如 (湖北师范学院 生物系，湖北黄石 435002) 摘要：对于Ecoli茵株用8种不同浓度的CaC1制备感受态细胞，然后转化各浓度的感受态细胞。实验结 果表明，不同浓度 CaCt2溶液处理所得到的感受态细胞，其转化效率有很大的不同。随着CaCI浓度增高， 转化效率也随之提高，在80mmoL／L～100mmoL／L时达到峰值 ，进一步提高CaC12的浓度，转化效率急剧下 降。还探讨 了一7O℃贮存时间对转化效率的影响。 关键词：质粒；感受态细胞；转化；转化效率 中圈分类号 ：Q一33 文献标识码：A 文章编号 ：1009-2714(2006)03—0030—03 0 引言 质粒转化是分子克隆中最常用的关键技术之一。1972年，1973年Cohen用 CaC1法成功地将R 因子和重组质粒 DNA分子导人E．coli细胞，此后，CaC1法作为一项经典转化技术沿用至今，其间在 转化方法上有过不少改进，为了掌握转化技术和转化条件，我们以E．coli作为受体菌，对影响质粒 DNA转化的重要因素——CaCl：浓度进行了研究。 1 材料和方法 1．1 材料和试剂 1．1．1 受体茵 E．coli由本实验室保存；pUC19由本实验室保存。 1．1．2 LB液体培养基 蛋白胨 10g，酵母膏5g，NaCI10g，蒸馏水 1L，PH7．0，121~C灭菌20min。固体 培养基加人琼脂 1．5％(m／v)抗性选择时加氨苄青霉素(Amp)母液 1：1000(v／v)． 1．1．3 氨苄青霉素(Amp)母液(以下称Amp) 用无菌水配制成 100mg／mL，置 一20~C冰箱保存。 1．1．4 CaCI2溶液：称取适量无水 CaC12(分析纯)用超纯水配制20mmol／L，40mmol／L，60mmol／L， 80mmol／L，100mmol／L，120mmol／L，140mmol／L，160mmol／L的溶液，高压灭茵。含 15％甘油的CaC1， 溶液 。20mmol／L，40mmol／L，60mmol／L，80mmol／L，100mmol／L，120mmol／L，140mmol／L，160mmol／L，高 压灭茵。 1．2 仪器设备 无菌工作台，分光光度计，电子天平，恒温培养箱，高压灭菌锅 ，恒温摇床，恒温水浴锅 ，低温冰箱， 高速冷冻离心机，微量移液枪等。 1．3 方法 ． 1·3·1 受体茵的培养 从 LB平板上挑取新活化的E．coliDH 单菌落接种于5mLLB液体培养基 中，37℃下振荡培养2h一3h，到OD600=O．5左右，然后分装成50mL／份的培养液8份。 收稿 日期：2005一l1--20 作者筒介：王友如 (1972一 )，男 ，湖北孝感人，硕士，讲师，研究方向为基因工程与分子生物学。 · 3O · 维普资讯 1．3．2 感受态细胞制备 1)将培养液转人大离心管中，冰上放置 10min，然后于4~C下5000r／min 离心 10min． ’ 2)弃上清，用预冷的各浓度CaC12溶液 10mL分别轻轻悬浮各管细胞，冰上放置20min后 ，4~C下 5000r／min离心 10min． 3)弃上清，各离心管中分别加人4mL预冷的含 15％甘油的各浓度CaC12溶液，轻轻悬浮细胞，冰 上放置5min． 4)制备的感受态细胞悬液分装成200uL的小份贮存于一70