高氧暴露下新生大鼠肺组织及Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮钠通道的表达及功能研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 高氧暴露下新生大鼠肺组织及Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮 钠通道的表达与功能研究 刖 吾 近年来，随着早产儿管理技术和治疗手段的发展，极低和超低出生体重儿的 存活率有了明显改善。但随之而来，因肺组织尚未发育成熟，加上吸入高浓度氧 dysplasia,BPD)的发病率在逐年上升。由于目前缺乏有效的监控手段及治疗方法， 重患多于生后1年内死亡，即使幸存者，儿童早期呼吸系统疾病的高患病率，以 及远期神经发育障碍也严重影响了患儿的生活质量。 研究表明炎症反应在BPD发生、发展中发挥了重要作用。由于炎症反应增加 了肺泡．毛细血管通透性，大量白蛋白和其它血清蛋白渗出，使得肺水肿成为BPD 早期的主要病理表现之一。 sodium 大量体内研究证实，阿米洛利(amiloride)敏感性上皮钠通道(epithelial 选择性和对亚微摩尔量的阿米洛利敏感为特征，在呼吸道上皮主要由三个同源亚 基0t，p和Y组成，与肺内液体清除密切相关，而II型肺泡上皮(alveolarepithelial II)细胞是实现钠水重吸收的主要功能细胞。以往研究表明ENaC功能 typeII，AT 障碍不仅与多种病理情况下肺水肿的发生有关，而且决定了肺水肿的预后。然而， 有关BPD早期ENaC表达和功能的研究较少，且结论还不明确。 因此，本研究采用经典的高氧致新生大鼠BPD模型，利用real．timePCR和 western 时原代培养新生大鼠的ATII细胞，利用膜片钳技术和流式细胞技术，记录暴露高 氧中的ATII细胞阿米洛利敏感性钠电流和阿米洛利敏感性体积变化，以确定高氧 暴露下ENaC表达变化与其功能的相关性。 方法 一、高氧暴露下新生大鼠肺组织ENaC表达检测 l、BPD动物模型制备、分组与标本采集： 将自然分娩的新生Wistar大鼠，随机分为高氧组和对照组，每组32只。高 温度21--250C。每天定时与对照组间交换母鼠。对照组以同样护理条件置于空气 中。每组分别于高氧暴露后l、3、5和7天随机选取8只鼠，取肺待检。 2、Real．time mRNA表达： PCR技术检测肺组织0c．、p一和丫一ENaC RT Kit反转录合 利用总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，利用TIANScript GREEN进行荧光定量分析，利用 成cDNA，Exicycli雕96荧光定量仪和SYBR 2-AACT法计算ENaCmRNA相对表达量。 3、Western blot技术检测肺组织0【．、p．和7-ENaC蛋白表达： 蛋白提取并定量，应用8％凝胶进行SDS．PAGE分离，将蛋白转至PVDF膜， 用TBS配置5％脱脂奶粉封闭PVDF膜，一抗4C过夜，二抗37℃孵育l小时。 应用ECL试剂盒发光，分析图像。 二、高氧暴露下新生大鼠ATⅡ细胞ENaC表达检测 1、新生大鼠ATII细胞的分离、纯化及鉴定： 出生24小时内的Wistar大鼠，无菌取肺，采用胰酶和胶原酶联合消化分离 细胞，应用差速贴壁和免疫粘附法纯化细胞，分别于21％02和85％02培养箱内进 行原代培养。应用SP—C免疫荧光染色及透射电镜进行细胞鉴定。分别于高氧暴露 后1、2和3天收集细胞。 2、Real．time mRNA PCR技术检测AT II细胞中仅．、p．和丫．ENaC —o、I 表达： 方法同一、2 3、Westem blo