高氧致CLD早产鼠肺细胞凋亡、增殖及间质纤维化的动态变化及其机制研究.pdfVIP

中文摘要 刖 吾 低氧血症是合并心肺疾病早产儿最常见的临床表现，也是导致中枢神 经系统不可逆性损害的重要原因之一，因此，临床医生对早产儿低氧血症均 能给予高度警惕和足够重视。然而恰恰忽视了氧毕竟属于气体药物，若长 时间吸入高浓度氧仍可导致不同程度的肺组织损伤，重者可发生早产儿慢 性肺疾病(chronic lung 可导致早产儿CLD，但目前高浓度氧仍被认为是CLD发生的最危险因素及 最主要原因。近年来，随着极低体重儿抢救存活率的提高，其发病率国外已 达30％～40％，而我国也呈逐年上升趋势。因其发病机制尚不清楚，故目 前仍无有效的监控手段及防治措施。以往一直认为肺间质纤维化是CLD 的主要病理变化，而近年来国内外学者均注意到肺发育障碍已成为影响 CLD预后及早产儿日后生活质量的重要因素，故提出肺发育停滞是CLD的 新特征。因此，研究高氧致早产儿CLD发生中肺形态学动态演变规律，探 索其发病机制已成为当今新生儿领域亟待解决并最具挑觇洼的研究课题之 ’一O 目前有关CLD发生机制的研究多集中于：1)因早产儿体内抗氧化系统 尚未发育成熟，吸入高浓度氧后，大量的氧自由基及活性氧生成，使肺内氧 化／抗氧化系统失衡，从而导致氧化应激性肺损伤；2)病程初期大量炎性细 等前炎症因子，使中性粒细胞从血管腔迁移、聚集到肺组织，通过释放氧自 由基、蛋白水解酶等而引发肺部的炎症反应。上述研究侧重阐明了高氧诱 导肺损伤的发生机制，而有关细胞凋亡是否参与CLD的发生过程?高氧是 抑制还是诱导肺细胞的增殖效应?目前结论各异。而关于Ⅱ型肺泡上皮细 IIalveolar 胞(type epithelial 肺组织纤维增生的机制等诸多问题，目前研究甚少。 本研究以高氧致早产鼠CLD模型为对象，应用分子生物学等检测技 术，观察肺形态的动态演变过程；研究肺细胞的凋亡及其发生机制；探索肺 细胞增殖的动态效应及其细胞周期的调控机制；并试图阐明CLD肺间质纤 维化的发生机制。从而为完善早产儿CLD的发生机制及寻求有效的防治 途径奠定实验基础。 材料与方法 一、动物模型 实验组将早产的SD大鼠(连同代母鼠)生后即置于氧箱中，持续输入 70％，每天定时开箱0．5h，添加水、饲料及更换垫料，并与对照组交换母鼠 以避免因氧中毒而致喂养能力下降。对照组FiO：为0．21(即空气)，具体 方法及实验控制因素同实验组。 二、实验标本采集及处理 肺形态学观察、免疫组织化学、原位杂交及脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导 的原位缺口末端标记(TUNEL)检测的标本置于4％多聚甲醛中固定；用于 超微结构观察的标本置于2．5％戊二醛中固定；用于酶联免疫吸附法(en— linked tran— zyme chain scriptionpolymerase 中，于-80℃冰箱中冻存。 三、实验方法及检测指标 1．肺形态的研究 1)光镜下观察：①观察肺组织的病理变化；②放射状肺泡计数(radical alveolar Ima— ging 及板层小体(LB)变化。 2．肺细胞凋亡及其机制研究 index，AI)。 1)TUNEL技术：观察肺细胞凋亡指数(apoptosis 达。 ·2· mRNA表达。 3)RT．PCR技术：测定肺组织Caspase-3 3．肺细胞增殖及其机制的研究 cell Nuclealantigen，PCNA)指数o depend- 2)原位