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淫羊藿对成骨细胞增殖活性的影响F.-H. Meng a , Y.-B.Li a ,Z.-L. Xiong a ,Z.-M.Jiang b ,F.-M.Li a, ?（沈阳药科大学药学院，中国沈阳文化路103号，110016；沈阳军区总医院）摘要用淫羊藿提取物研究体外增殖活性。以成骨细胞样UMR106细胞作为成骨细胞模型，发现乙醇和正丁醇的处理的淫羊藿粗提取物有刺激成骨细胞增殖活性的作用。三大类黄酮化合物（淫羊藿苷、朝藿定B、朝藿定C）通过活性引导实验被分离出来，并对细胞增殖的影响进行了研究。淫羊藿苷在成骨样细胞UMR106的增殖中产生了最重要的促进效果。结果表明，淫羊藿提取物可能对成骨细胞有潜在活性，黄酮类化合物如淫羊藿苷可能是刺激成骨细胞增值的有效成分。关键字:淫羊藿; 成骨细胞UMR106; 成骨细胞的增殖活性引言淫羊藿（小檗科）是中国著名的一种中草药，是淫羊藿干燥的地上部分。箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿（中国药典委员会，2000）。他们常用在心血管疾病和其他慢性疾病治疗（不孕，健忘乏力，阳痿和老年功能性疾病），在中国已经超过了2000年（郑，等人，2008）。最近，淫羊藿被应用于许多抗骨质疏松的配方中（高，等人，1999）。药理研究还表明，它具有抗骨质疏松症潜在活性（李，等人，1996；马，等人，2002）。但目前尚不清楚淫羊藿是否影响成骨细胞的增殖以及抗骨质疏松症活性成分是什么。这项研究的目的是从淫羊藿的地上部分筛选出具有抗骨质疏松活性的组分，并通过活动引导法分离出活性成分，以便考虑淫羊藿的质量控制标准，并确定抗骨质疏松的活性的先导结构。材料和方法材料在2001年9月于中国陕西省汉中市一个山谷里收集了淫羊藿的地上部分（包括枝和叶），原材料被中国沈阳药科大学生药学教授齐士孙认同，参考标本（编号No.E已存入沈阳药科大学的植物标本室，成骨细胞UMR106是在北京医科大学获得的（来源于澳大利亚维多利亚州的墨尔本大学的一个附属医院）。细胞培养基（MEM）来源于Gibco（美国），胎牛血清（FCS）来源于TBD生物工程有限公司（中国，天津），胰蛋白酶是由Diffco（美国）提供，Nunc公司（丹麦）提供了组织培养材料，MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基溴化]从Sigma公司（美国）提供。其它试剂均为分析纯。提取分离用95％乙醇提取淫羊藿干燥的地上部分（2000克），提取液排出并减压浓缩，所生成的黑色残余物（430克）用热蒸馏水浸泡，然后依次用石油醚（沸点60-90），乙酸乙酯和丁醇萃取。将有机溶剂蒸发，残余物称重，并将这些提取物与成骨细胞UMR106在试管内共同培养并测定其活性。丁醇提取物的暗棕色残余物（20克）被发现具有活性，然后将其进行硅胶柱层析法，柱子的梯度三氯甲烷：甲醇为100：1→1：1。收集到的洗出液通过薄层色谱法进行纯度检查，将那些相同Rf值的进行合并。三个化合物通过活动引导法由洗脱物获得。淫羊藿苷（参照图1）是从洗出液95?110，在100：15的梯度下，在甲醇中重结晶，从而得到180毫克；淫羊藿定B是从洗出液120?128，在100：20的梯度，用硅胶薄层色谱精炼，用乙酸乙酯 - 甲醇（10：3）作为显影溶剂在氯仿—甲醇中重结晶得到110mg；淫羊藿定C是从洗出液181?195，在100：30的梯度下，在氯仿—甲醇中重结晶得到130毫克。通过反相高效液相色谱法的检测，这些化合物的纯度大于99.0％，它们的物理特性通过与文献数据值（郭等，1996;黑田等人，2000;孙等人，1995）比较具有一致性。试验样品的制备淫羊藿和它的馏份溶解在乙醇或蒸馏水中，得到完全溶解的溶液（10 mg/ml,，表示为每毫升的原料的重量计）。将化合物溶解在乙醇中，得到10 mmol/l的溶液，氟化钠溶于蒸馏水灭菌，得到10 mmol/l作为对照的溶液，所有样品制备一式两份。将溶液用0.2无菌滤波器（吉尔曼科学），并储存在4℃下，使用前所有的样品在细胞培养基中稀释到所需的浓度。空白对照组为未经细胞培养基处理的细胞和同样比例的乙醇或水的测试样品。细胞数和吸光度之间的相关性为了验证该细胞增殖，进行了细胞数和吸光度之间的关系研究。在接种到96孔培养板之前，在细胞培养基上稀释到八个等浓度梯度并用血细胞计数器计数。在37℃和5℃的CO2的条件下，将MTT溶液加入并行吸光度测定。结果表明在3.1*103-4.0×105细胞/毫升，范围内有很明显的线性关系：吸光度（Y）和细胞数（X）的线性关系Y =0.034+2.03×10-6（R2 =0.9958。细胞增殖的时间过程为了建立所需的有丝分裂的生物测定的最佳培养期，对增殖的时间过程进行研究。临床研究表明，氟化钠（NaF）在骨质疏松症患者用于