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《微生物学基础实验》 （胡开辉主编） 中国林业出版社 （节选改编） 任课教师： 刘 芳 教学时数： 20学时 实验周数： 4周 实验学时数：5学时/周 实验内容： 一：培养基制备与灭菌 二：无菌操作技术 三：自生固氮菌的分离 四：养分和温度对细菌生长的影响 五：荚膜染色与革兰氏染色 六：微生物大小与数量的检测 第一部分： 培养基的配制与灭菌 Ⅰ培养基 培养基是按照微生物生长发育的需要，将不同组合的营养物质调制而成的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。自然界中，微生物的种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，所以培养基在组成原料上也各有差异。但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育所需的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（PH值）、一定缓冲能力、一定氧化还原电位和合适的渗透压。 一、培养基的主要成分 1、水：水是构成微生物细胞的重要物质，其含量约占70%～90%。大部分营养养物质必须先溶解于水中，才能为微生物细胞吸收，而且微生物细胞内进行的各种合成代谢、分解代谢等都是在水溶液状态下进行的。因此，水是微生物生命活动不可缺少的条件。一般情况下，配置培养基时，可用自来水、井水，天然水中含有的微量杂质不仅对微生物无害且可作为营养物质被微生物吸收利用，但在测定微生物某些生理特性、合成产物数量以及其它要求精确性高的实验时，则必须采用蒸馏水，以保证结果的准确。 2、碳源：碳素是组成微生物细胞的主要元素，也是异养生物生命活动的能源。可作为培养基碳源的物质很多，最常用的碳源为葡萄糖，因为能利用葡萄糖的微生物很多。其它糖如蔗糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、纤维素，以及脂肪、蛋白质、有机酸、醇类、烃等都可作为培养不同微生物时选择使用的碳源。 根据微生物对碳素同化能力的不同，微生物可分为自养型（无机营养型）和异养型（有机营养型）两大类。自养型的微生物以二氧化碳为碳素营养在在细胞内合成有机物质，故不需要向他们提供现成的有机碳化物，只需满足它们用以还原二氧化碳的能源条件即可。异养型微生物只能使用现有的有机碳化物作为碳素营养，并从取得能量。总的来说，自然界中绝大多数微生物是异养型的腐生性微生物，即能在死的有机体及其制备物上生活。我们了解碳源和微生物的关系，目的在于制备营养基时即可根据微生物的生理特性，选择适宜的碳源物质。 3、氮素是组成细胞蛋白质的主要成分，也是构成所有微生物细胞的基本物质。除去某些固氮细菌可利用分子态氮素外，其它生物都需要化合态氮作为氮素养料。常用于培养基的氮源，分无机氮和有机氮两类：无机氮有铵盐、硝酸盐等，大多数真菌可利用铵盐及硝酸盐，许多细菌能利用铵盐，但对硝酸盐则不能利用。有机氮有蛋白胨、牛肉膏或牛肉浸汁、各种氨基酸等，此外，豆芽汁、酵母膏等也是常用的有机氮源。一些含蛋白质较多的农副产品如豆饼粉、花生粉、棉籽饼等常可作为培养放线菌的氮源，又如鱼粉、蚕蛹等，也可作为培养某些微生物的氮素养料。 根据不同微生物在氮素合成代谢上的差异，可将其分为氨基酸自养型和氨基酸异养型两类。氨基酸自养型微生物，只需要无机氮化物如铵盐、硝酸盐就可生活，它们也可利用有机氮化物如尿素、氨基酸以及更复杂的蛋白质作为氮源。氨基酸异养型微生物在利用含氮化合物合成蛋白质时，由于缺乏合成某些氨基酸的能力，因此在培养这些微生物时，要加入某些现成的氨基酸作为特殊氮源。我们必须了解不同微生物在氮素营养上的一般性和特殊性，才可根据具体情况选择适宜的氮源。 4、无机盐类：微生物生长所需的矿物质养料如磷、硫、钾、钙、镁、铁等，一般采用含有这些元素的盐类即可，如磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、氯化铁、硫酸锰等。当用天然的植物性或动物性物质制备培养基时，往往不必加这些盐或只加一部分（如磷酸盐），因为它们本身即含有这些元素。除某些特殊微生物的特殊需要外，一般在配置培养基时，不加微量元素，因为在营养物质及天然水中已含有一些可供微生物生长的微量元素。 5、生长素：微生物生长所需的生长素大部分是维生素物质，它们是许多酶的组成部分具有维持微生物代谢的功能。在制备培养基时，除合成培养基应考虑加入某些维生素外一般也不必特意加入维生素，因在天然的材料和制品中如蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麦芽汁、豆饼粉、麸糠中，都含有维生素。酵母膏和麦芽汁、胆浸汁是富有维生素的物质，在配置某些培养基时，加入这些物质，目的在于为某些微生物提供所需维生素物质。 二 培养基的类别 (一)、按照营养物质来源的分类 按照配置培养基的营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基、合成培养基三类。