H5N1禽流感病毒核酸多重RT—PCR检测方法建立.docVIP

H5N1禽流感病毒核酸多重RT—PCR检测方法建立摘要：根据禽流感病毒的基质蛋白（M）基因序列和H5亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因、神经氨酸酶（NA）基因设计并合成了三对特异性引物，用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鉴定方法。试验证明，建立的多重PCR方法可以将H5N1与H6N2、H9N2有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性，适合在基层动物防疫和监督部门进行H5N1禽流感病毒核酸的检测。 关键词：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；检测 中图分类号：S854.43 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）04-0005-03 高致病性禽流感是一种严重危害养禽业发展的烈性传染病，被OIE列为必须通报的传染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，AIV除了可感染禽类外，部分亚型还可感染人、猪、马等。AIV基因组由包括基质蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神经氨酸酶（NA）基因在内的8个负链单股RNA片断组成，其中M基因组序列高度保守，HA基因组变异性最强，NA基因组变异次之。HA基因和NA基因某些位点的变异可导致不同的HA亚型和NA亚型[1]，目前发现AIV有16个HA亚型和10个NA亚型，其中H5、H7亚型常表现为高致病性，除了给养禽业带来严重经济损失外[2]，还可感染人，甚至导致死亡[3]。目前，病毒分离、血清学试验仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法，但病毒分离不仅操作繁琐、复杂和耗时，难以对AI进行快速诊断，还存在潜在散毒的危险。PCR方法是一种基因体外扩增技术，可以在数小时内对某片断基因扩大数百万倍。该技术具有特异性强、敏感性高、检测快速等特点，已广泛应用于生物学、医学、兽医学的各个领域。多重分型PCR是一种特殊PCR形式，其最突出的特点是一次反应可以达到既分型又能够鉴定亚型的目的，在A、B、C三种流感及其他病源混合感染的鉴别诊断上具有独特优势和很高的实用价值[4，5]。根据RT-PCR技术的原理，研究建立了鉴定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技术。 1 材料与方法 1.1 试验用材料 AIV H5N1抗原，购自哈尔滨维科生物技术开发公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、鸡减蛋综合征病毒（EDSV）和传染性支气管炎病毒（IBV），本室留存。 1.2 生化试剂 Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，内含Mg2+）、RNA酶抑制剂、反转录酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNA提取液购自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亚砜购自上海生工生物工程有限公司。 1.3 引物设计及合成 参考基因库中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，经Clustalx序列软件比对后，选择在保守区域用Primer Primer5.0软件设计了3对引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 1.4 病毒RNA的提取 （1）1.5 mL离心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL样品，混匀，室温放置5 min。 （2）加入120 μL -20℃预冷的氯仿，混匀，室温放置3 min。 （3）12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，取上清120 μL于另一离心管中，加120 μL -20℃预冷异丙醇，室温放置5 min。 （4）12 000 r/min， 4 ℃离心10 min，弃上清，加入600 μL -20 ℃预冷75%乙醇，上下颠倒，12 000 r/min， 4 ℃离心5 min，弃上清。室温放置约3 min近干燥。 （5）加20 μL 0.1% DEPC处理过的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存备用。 1.5 多重RT-PCR 采用总体积为50 μL的多重PCR反应体系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反转录酶（AMV）1 μL，二甲基亚砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC处理过的水补足至50 μL。振荡离心混匀后，在PCR仪上设定程序进行扩增，通过对反转录条件及多重PCR变性、退火、延伸的温度和时间以及循环次数等的优化，最终确定其反应参数为50 ℃反转录30 min，94 ℃预变性2 min后，