甲基莲心碱对糖尿病血管内皮细胞及交感神经节损伤的作用及机理研究.pdfVIP

Y1 摘要 摘要 研究背景：糖尿病是危害人类健康的四大疾病之一，目前我国是世界上糖 尿病发病人数最多的国家。糖尿病严重影响着人民健康和社会发展，对糖尿病 的防治已成为医学科学工作者的一个重要课题。糖尿病的主要危害不是糖尿病 本身，而是在糖尿病发展过程中出现的各种慢性并发症。糖尿病引发的交感神 经和心血管损伤并发症严重影响患者的生活质量，是致残、致死的重要原因。 血管内皮细胞是具有血管调节功能和分泌作用的重要器官。颈上交感神经节的 节后神经纤维可分布至心神经丛，影响心脏和血管的活动。研究报道莲籽芯具 有降血糖作用。甲基莲心碱(neferine，NeD是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色 胚芽(莲籽芯)中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱。本实验研究探索甲基莲 心碱在糖尿病及其并发交感神经和心血管损伤中的作用及其可能作用的新靶 点，并为糖尿病及其并发症的防治提供新的实验依据。 目的：1、通过观察高糖致血管内皮细胞基因表达变化及甲基莲心碱的影响， 了解甲基莲心碱对高糖致血管内皮细胞损伤的保护作用及可能机理；2、几乎全 部与人类疾病有关的基因与大鼠基因有同源性。实验观察甲基莲心碱对2型糖 尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰岛素及血压影响的同时，了解甲基莲心碱对糖 尿病模型大鼠颈上交感神经节CCL5及CCR5表达的影响，探讨糖尿病及其并发 症的发病机制及甲基莲心碱的作用机理；3、应用差异蛋白质组学方法观察糖尿 病模型大鼠颈上交感神经节相关蛋白质分子的变化，筛选药效作用靶点，揭示 甲基莲心碱防治糖尿病并发症的作用机理，为临床推广应用提供实验依据。 方法：1．以高浓度(44mM)的葡萄糖作用于原代培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)共孵育5天诱导模拟糖尿病内皮细胞损伤。应用硝酸还原酶法检测细 胞上清液中一氧化氮(No)的含量；荧光法测定细胞内活性氧(ROS)水平； RT2ProfilerTM 美国Superarray PCR基因表达谱芯片进行多基因分析；通过免疫组 织化学、原位杂交、RT-PCR和蛋白印迹分析从内皮细胞基因表达谱中筛选出的 mRNA和 和糖尿病并发症有重要相关性的趋化因子5(CCL5)及其受体CCR5 蛋白表达变化，并观察甲基莲心碱对其影响。 2．选用雄性SD大鼠，通过高糖高脂饮食加腹腔小剂量注射链脉佐菌素复 H 摘要 制糖尿病大鼠模型，运用生化、放免、血压测定、双向电泳、免疫组织化学、 原位杂交、RT-PCR和蛋白印迹等检测手段和方法，观察甲基莲心碱对糖尿病大 鼠体重、空腹血糖、血脂、血胰岛素、血压及颈上神经节和心肌组织CCL5及其 受体CCR5mRNA和蛋白表达的影响。 3．通过差异蛋白质组学技术筛选出糖尿病大鼠模型颈上交感神经节相关蛋 白质的变化并观察甲基莲心碱的作用，并将其中与糖尿病并发症有重要相关性 进一步应用蛋白印迹方法检测，确定甲基莲心碱对神经节DDAHl和UCHLl表 达的影响。 结果：1、高糖孵育HUVEC细胞5天后，细胞培养上清液中NO含量显著 性减少，细胞内ROS水平明显升高；高糖同时使用甲基莲心碱能显著性增加高 糖所致NO含量的减少，降低高糖所致ROS水平的升高。PCR芯片结果发现慢 性高糖处理后有16个基因上调，10个基因下调，其中变化最大的是与内皮细胞 mRNA增加，甲基莲心碱能纠正高糖引起的CCL5和CCR5mRNA的表达上调。 蛋白印迹结果发现慢性高糖引起CCL5和CCR5蛋白表达上调，甲基莲心碱能显 著降低高糖所致的CCL5和CCR5蛋白表达的上调。 2、甲基莲心碱处理后使2型糖尿病模型大鼠体重增加，血压降低，心率减 慢，空腹血糖、血胰岛素、总胆固醇、甘油三酯降低，高密度脂蛋白升高，即 甲基莲心碱具有较好的改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗和调整脂代谢紊乱作用。 RT-PCR和原位杂交结果显示糖尿病大鼠颈上神经节和心肌组织中CCL5和 CCR5mRNA的表达上调，甲基莲心碱能降低CCL5和CCR5