第七章胚胎干细胞.docVIP

第七章 胚胎干细胞 二、干细胞的概念 1、干细胞： 具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能细胞。 2、分类 （1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES细胞）生殖干细胞（embryonic germ cells, EG细胞）。具有全能性，能够分化成所有细胞类型， 进一步形成机体的任何组织和器官。 （2）多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。 （3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。 干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化的细胞型的细胞。 动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供不同的细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供替代细胞以修复身体不同部分的损伤。 干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤中失去的细胞。 使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿瘤形成的风险。 目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下: ①胚泡,可以提供多能干细胞; ②胎儿组织,可以提供多能或者专能干细胞; ③脐带血,可以提供专能干细胞; ④成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。 三、胚胎干细胞 1、概念 胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。 ES细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍能具有发育成三个胚层的潜能。 这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。 ES细胞的全能性（totipotenty），是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞发育成完整动物体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次表达。 ES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。 ES细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胞核移植。如果ES细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成个体，则表明ES细胞具有全能性。 例如，将绵羊的类ES细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类ES细胞具有发育全能性。 2、ES细胞研究发展史 1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman用囊胚内细胞团(ICM)建立小鼠ES细胞系 1998年美国Thomson从人的体外受精囊胚中分离得到了ES细胞。同年约翰霍普金斯大学的Shamblott等从人的PGC细胞中分离得到人的全能性干细胞。 人ES细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植打下了基础。 其他动物只获得了类ES细胞。 1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。 目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。 3、胚胎干细胞的性质 ①衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞； ②永生化(immortal)； ③能维持稳定的正常的二倍体染色体结构； ④有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化； ⑤能参与胎儿所有组织的发育过程； 4、胚胎干细胞系的建立过程 4.1 概述（见笔记） 4.2 胚胎干细胞的分离（三种方法） 酶消化后培养；免疫方法去处滋养层细胞；流式细胞仪分离法 4.3 培养条件： (1) 特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。 (2) 以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养层细胞。 (3) 必须加入LIF，抑制细胞分化。 早期胚胎及PGCs的培养： 将早期胚胎或PGCs置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37－39度条件下进行培养。 培养液一般为DMEEM+15%FCS。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF. 3-巯基乙醇等。 传 代： 进行体外培养时，当ICM增殖后或PGCs出现ES样克隆后即可传代。ESC的增殖速度很快，小鼠ESC每7－8h倍增一次;猪类ESC每20h倍增一次;羊类ESC，每40－50h倍增一次;牛类ESC每18－24h倍增一次。 传代时一般是用胰酶EDTA消化，再用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。 5. 胚胎干细胞的鉴别 （1