五引物单管聚合酶链反应(PCR)扩增法快速测定人CYP2D6~10等位基因的类型.PDF

第 33卷 分析化学 ( FENX I HUAXU E) 　研究报告 第 2 期 　　　　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　 2005年 2 月 Ch ine se Jou rnal of A nalytical Chem istry 155 ～160 五引物单管聚合酶链反应 ( PCR)扩增法快速测定 人 CY P2D 6 10等位基因的类型 卜　莹 　张晓丹 　马 　涛 　周国华 (华东医学生物技术研究所 ,南京 2 10002) 摘 　要 　以人 CYP2D6 10等位基因位点为研究对象 ,建立了一种由 5条引物同时 PCR 扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法 。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上 ,在 内引物 3 端′引入了一个人工错配 碱基并在 5 端′附加一段 “尾巴 ”作为引物的锚定部分 ,使扩增反应的特异性得到了提高 。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成 SN P 3种可能等位基因类型的快速检测 。实测了 47 份样品的 CYP2D6 10 等位基因 的类型 ,并随机对其中 20份样品的测定结果用 RFL P 法进行了验证 ,结果完全一致 。结果表明本法简便 、快 速 ,结果准确 。 关键词 　单核苷酸多型性 ,聚合酶链反应 ,等位基因特异性扩增 ,人工错配碱基 1　引　　言 随着人类基因组计划的完成 ,研究方向已从基因组结构的分析转向功能分析 ,寻找与疾病发生 、发 展相关的基因多态性标志位点 ,力争在疾病发生之前延迟或阻止疾病的发生 ;研究不同遗传背景的人与 药物毒副作用的关系 ,力争实现真正的个体化给药 ,提高药物疗效和降低药物不 良反应 。因此 ,在后基 ( ) 因组计划中单核苷酸多态性 SN P ,即基因多态性的分析及其检测仪器的开发是 目前各国政府重点投 资和关注的项 目之一 。SN P 的数量极其庞大 ,发展一种高通量 、快速和低价格的检测方法十分必要 。 ( ) 细胞色素 P450酶 cytoch rom e P450 , CYP 是人体内参与内源性物质和外源性物质代谢的重要代谢 酶 。本实验针对在东方人群中高发的 CYP2D 6 10 等位基因突变 [ 1 ] ,建立了一种在单管中通过一次性 PCR 扩增来判断其 SN P类型的新方法 。 2　方法原理 本方法是在四引物等位基因特异性双向扩增技术 [ 2 ～5 ] 的基础上建立的。一对外引物用于扩增含有 CYP2D 6 10位点的片段 ,两条内引物用于测定等位基因的类型 ,该引物的 3 末′端设计不同的碱基以分 别与等位基因 C188 →T的 2 种存在形式结合并延伸 。根据扩增出条带的长度来确定等位基因类型 。为 了提高方法的特异性 , 在内引物的 3 端′一定位置引入了一个人工错配碱基 [ 6, 7 ] , 以降低非特异性带的生 成及避免假阳性结果的出现 。此外 ,还在两条内引物 5 端′附加一段由 10 个 G和 C 组成且与模板 DNA 不匹配的 “尾巴 ”作为锚定引物 [ 8 ] ,并由此引入了第 5条特异性扩增辅助引物 。第 5条辅助扩增引物的 序列与内引物的 5 端′尾巴完全一致 。在 PCR 反应的最初循环 ,该引物不起作用 ,一旦内引物中的任一 条或两条同时与模板结合并延伸 ,与之相对应的外引物向其 5 端′方向延伸 ,就形成了一段可以与 “GC 尾巴 ”完全互补的序列 ,在以下的循环延伸反应中 ,将以此片段为模板 ,在第 5 条辅助引物和外引物的 作用下进行 PCR 扩增反应 ,这样可以使特异性延伸条带的量增加 ,能克服因人工错配碱基的引入而产 生的特异性条带减弱的现象 。其方法原理见图 1。 3　实验部分 3. 1　试剂和仪器 ( ) (