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柠檬酸发酵 摘要：柠檬酸是微生物发酵法生产的重要有机酸，用途极为广泛。柠檬酸发酵菌黑曲霉在柠檬酸工业中占有重要地位。该文论述了柠檬酸发酵菌黑曲霉的发酵机制、代谢调控及柠檬酸积累的机理,黑曲霉代谢工程的控制及菌株的改良，并对黑曲霉代谢工程的改造进展进行总结。 关键词：柠檬酸;黑曲霉;代谢工程;改造 Citric Acid Fermentation Abstract: Citric Acid is an important organic acid produced by microorganism fermentation and is widely used in industries. Aspergillus niger is a fungus that plays an important role in Citric Acid production. The thesis discusses the fermentation mechanism and metabolic regulatory mechanism of Aspergillus niger, the accumulation mechanism of Citric Acid, the control of Aspergillus niger’s metabolic engineering and the improvement of the microbial strain, and summarizes the transformation progresses made in Aspergillus niger’s metabolic engineering. Keywords: Citric Acid; Aspergillus niger; metabolic engineering；improvement 一、柠檬酸 1、简介 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。化学名称2-羟基丙三羧酸，英文文献俗名citric acid。无色或白色晶体，无臭，味极酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反应。　　 化学式如下： 柠檬酸是生物体主要代谢产物之一, 在自然界中分布广泛，主要存在于柠檬、柑橘、梅子等果实中。其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。结晶时控制适宜的温度可获得无水柠檬酸。60年代开始，生产柠檬酸年总产量居世界第一，出口量一直占国内总产量的50%以上。目前柠檬酸生产主要采用薯干原料深层发酵法。这是我国柠檬酸生产比较成熟的发酵工艺。原采用黑曲霉作为菌种,直接使用薯干淀粉发酵生成柠檬酸，产酸浓度为6~8%，转化率80%以上。如今，生产厂家万吨级以上的有6家。主要有滩坊英轩（生产能力为30万吨/年）、安徽丰原生物化学集团公司（生产能力为25万吨/年）、山东日照鲁信金禾（生产能力为20万吨/年）等。 二、柠檬酸发酵黑曲霉积累柠檬酸的机理 产生柠檬酸的微生物有真菌、细菌和酵母，但自从1917年发现黑曲霉能够生成柠檬酸后, 尚未发现其它属的微生物比黑曲霉更好。现在人们大多利用黑曲霉及温氏曲霉的菌株生产柠檬酸，因为它们的柠檬酸产量最高, 且能用多样化碳源, 所以柠檬酸发酵菌黑曲霉的育种研究显得至关重要。 黑曲霉柠檬酸生物合成途径 柠檬酸生物合成涉及的生化途径有: EMP、HMP、TCA、乙醛酸、丙酮酸羧化、ɑ- 氧化。原料不同, 使用的发酵菌种不一样，它们的生化途径也有不同。黑曲霉利用糖类发酵生成柠檬酸, 其生物合成途径现普遍认为是: 葡萄糖经EMP、 HMP途径降解生成丙酮酸, 丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA,另一方面经CO2 固定化反应生成草酰乙酸,草酰乙酸与 CoA 缩合生成柠檬酸。 生长期与产酸期都存在EMP与HMP途径，前者EMP:HMP=2:1，后者EMP:HMP=4：1。 黑曲霉柠檬酸产生菌中存在TCA循环与乙醛酸循环，在以糖质原料发酵时，当柠檬酸积累时，TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱。 由于TCA和乙醛酸循环被阻断或减弱，草酰乙酸是由丙酮酸（PYR）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成的。即由两个CO2固定化反应体系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化CO2生成草酰乙酸为主。 黑曲霉柠檬酸发酵的代谢调控 柠檬酸是TCA中一员, 是许多组织和微生物中广泛存在的一种重要有机酸,它不仅为许多微生物利用同化, 而且是一种重要的代谢调节因子。通常微生物细胞中合成的柠檬酸进一步经TCA 循环, 生物合成其他有机酸，提供合成细胞物质的中间体或彻底氧化产生能量, 为细胞活动和耗能合成代谢提供能量。因此正常生长的细胞中柠檬酸是不会过量积累的。而黑曲霉积累柠檬酸受到四个方面的调节: 糖酵解及丙酮酸代