血清蛋白NC薄膜电泳法.docVIP

实验二 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 目的要求 （1）了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维素薄膜电泳操作技术。 （2）测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量。 原 理 醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrane electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度约0.1——0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。目前，国内有醋酸纤维薄膜商品出售，不同厂家生产的薄膜主要在乙酰化、厚度、孔径、网状结构等方面有所不同，但分离效果基本一致。 醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点： （1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测量的精确性。 （2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲溶液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45——60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。 （3）灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需2μL血清，甚至加样体积少至0.1μL，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离区带。临床医学检验利用这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。 （4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白的等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 （5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。 本实验以醋酸纤维素为电泳支持物，分离各种血清蛋白。血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各种脂蛋白等。各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、分子量、等电点及形状不同，在电场中迁移速度不同。分子量小、等电点低、在相同碱性PH值缓冲体系中，带负荷电荷多的蛋白质颗粒在电场中迁移速度快。例如，以醋酸纤维素薄膜为支持物，正常人血清在PH8.6的缓冲体系中电泳1h左右，染色后可显示5条区带。清蛋白泳动最快，其余依次为α1-α2-，β-及γ-球蛋白（如图2.1）。这些区带经洗脱后可用分光光度法定量，也可直接进行光吸收扫描自动绘出区带吸收峰及相对百分比。临床医学常利用它们间相对百分比的改变或异常区带的出现作为临床鉴别诊断的依据。此法由于操作简单，快速，分辨率高及重复性好等优点。目前，已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶的分离测定。 图2.1 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6为点样原点 试剂和器材 测试材料 未溶血的人或动物血清。 试剂 1．巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6, 0.07mol/L, 离子强度0.06) 称取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥钠（AR），置于三角烧瓶中，加蒸馏水约600mL，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL。置40C保存，备用。 2．血清蛋白染色 （1）染色液（0.5%氨基黑10B）：称取0.5g氨基黑10B，加蒸馏水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混匀溶解后置具寒试剂瓶内贮存。 （2）漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸馏水50mL，混匀置具塞试剂瓶中贮存。 （3）透明液：临用前配制。 甲液：取冰乙酸（AR）15mL，无水乙醇（AR）85mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 乙液：取冰乙酸（AR）25mL，无水乙醇（AR）75mL，混匀置试剂瓶内，塞紧瓶塞，备用。 （4）保存液：液体石蜡。 （5）定量洗脱液（0.4mol/L NaOH溶液）：称取16g氢氧化钠（AR）用少量蒸馏水溶解后定容至1000ml。 三、器材 醋酸纤维素薄膜（2×8cm），培养皿（直径9——10cm），解剖镊子竹夹子，点样器，直尺和铅笔，电泳仪及电泳槽，玻璃板（12×12cm），试管若干及试管架，吸量管（2mL，5mL），可见光分光光度计，吹风机，单面刀片，普通滤纸及臭氧化缸（可用普通容器代替）。 操作方法 一、仪器与薄