木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中高效表达.docVIP

木聚糖酶基因xynA在大肠杆菌中高效表达摘要 参照Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌木聚糖酶A基因序列，以引物拼接方式，人工合成采用大肠杆菌优势密码子的基因xynA，插入pET-20b载体，获得重组表达载体pET-20b-xynA。重组菌在16 ℃下诱导效果最好，10 h酶活达到42.05 U/mL，重组酶占全细胞蛋白的47%，粗酶在65 ℃和pH 5～8条件下很稳定。 关键词 木聚糖酶A基因；优势密码子；高效表达 中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2011）12-0326-02 β-1，4-D-木聚糖水解酶目前已经得到广泛应用，耐热、耐碱、热稳定性好是其理想的特征，其水解产物低聚木糖以木二糖、木三糖为主[1-2]。低聚木糖具有显著的双歧杆菌增殖能力、不被消化等特性，但是自然界木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性，影响了低聚木糖的产率。因此，构建产木聚糖酶的工程菌，已成为生物技术在食品工业的研究热点。 疏棉状嗜热丝孢菌是一种嗜热真菌，产生的木聚糖酶在高温和碱性条件稳定，降解产物中单糖含量很少[3]。该酶在原产菌中的表达需要木糖等诱导剂，但是嗜热真菌培养比较困难，产酶周期长且酶系复杂。在原核系统中重组表达的产量很低，不能满足应用要求[4]。该试验尝试采用大肠杆菌中的优势密码子，以引物拼接的方式合成基因，利用pET-20b载体在16 ℃下实现木聚糖酶在大肠杆菌中高效表达。 1 材料和方法 1.1 引物设计 根据Genebank中疏棉状嗜热丝孢菌DSM 5826木聚糖酶A基因序列，在不改变氨基酸的前提下使用优势密码子，设计14条引物合成基因xynA，相邻引物末端有互补区域以利于引物退火延伸（图1）。 1.2 引物片断的拼接 参照美国Promega公司的Altered SitesⅡ Protocol的方法，将14条引物混合磷酸化，产物75 ℃变性后，以大约1 ℃/min的速度缓慢降温至45 ℃退火，再迅速降至22 ℃终止退火。加入DNA聚合酶和连接酶，37 ℃下延伸和补平。 1.3 目的基因xynA的克隆 设计上下游引物C1和C2，EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点分别为黑体所示：C1：CCCGAATTCATG CAGACCACCCCGA AC；C2：CCCAAGCTTTTAGCCAACGTCAGCAACAG[2]。以拼接产物为模板，Ex-taq DNA聚合酶巢式PCR扩增基因。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循环29次；72 ℃ 10 min。产物回收后双酶切插入质粒pUC19位点。 1.4 重组表达质粒的构建和表达 以测序正确的质粒pUC19-xynA为模板，设计合成引物C3和C4（黑体所示分别为NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点）：C3：CCCCATATGCAGACCACCCCGAAC；C4：CCCCTCGAGTTA GCCAACGTCAGCA ACAG，以Probest DNA聚合酶进行扩增，条件同1.3。产物回收后双酶切插入质粒pET-20b相应位点。将重组质粒pET-20b-xynA转入大肠杆菌JM109，接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养液中，37 ℃振荡过夜后转接培养至OD600达0.6，加入IPTG至终浓度0.8 mol/L，分别在37、16 ℃下继续培养12 h，每隔2 h收集菌液。 1.5 酶活测定 木聚糖酶活性的测定是以燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色[2，5]。 2 结果与分析 2.1 基因的合成及重组表达质粒的构建 巢氏PCR法扩增出588 bp的片断（图2a），与设计基因序列一致。以pUC19-xynA为模板PCR获得目的基因，构建重组表达质粒pET-20b-xynA，酶切结果与预期一致（图2b）。 2.2 木聚糖酶在大肠杆菌中的重组表达 重组表达质粒转化大肠杆菌JM109，37 ℃诱导2 h酶活达到最大值3.99 U/mL，其后逐渐下降，菌液浓度在诱导4 h时达到最大值；16 ℃诱导10 h酶活性达到最大值42.05 U/mL，菌液浓度缓慢增大，12 h达到最大值（图3）。 收集诱导10 h时菌液破碎细胞，SDS结果表明，重组菌产生约23 kDa的特异条带，与预期蛋白相对分子量一致[2]。16 ℃诱导产生的重组酶在全细胞总蛋白中占比47%，比例比37 ℃诱导时高，但多数重组酶以不溶性的形式存在，复性处理可以重新检测到木聚糖酶活性（图4）。 2.3 重组木聚糖酶的酶活性质 粗酶在60 ℃稳定性很高，温育6 h后仍有80%的相对活性，70 ℃下失活很快。在60 ℃下温