维生素D-抗菌肽通路在肝硬化并发自发性细菌性腹膜炎发病和治疗中的作用.pdfVIP

·中文论著摘要· 维生素D．抗菌肽通路在肝硬化并发自发性细菌性腹膜 炎发病及治疗中的作用 目 的 D，250HD)水平，了解这类患者的维生素D状态，并探讨维生素D水平与肝脏 疾病严重程度的关系；通过检测肝硬化腹水患者腹腔白细胞维生素D受体(vitamin D bacterial 通路参与自发性细菌性腹膜炎(spontaneous 制：通过检测腹腔巨噬细胞经维生素D干预fii『后其VDR及LL．37水平变化情况， 明确维生素D对腹腔巨噬细胞LL．37应答的调控，探讨维生素D是否可增强腹腔 局部的抗菌免疫功能。 材料与方法 一、实验材料： 1、研究对象： 选择2011年4月至2011年12月期间于中国医科大学附属盛京医院第二感染 性疾病、肝病病房住院治疗的183例慢性肝炎或肝硬化患者为研究对象。所有患 者均行肝脏生化学、免疫学、病毒学及肾功能、凝血机制检测，肝硬化腹水患者 入院后行诊断性腹腔穿刺术检测，行肝脏影像学检查，并记录病例人口学及病因 学特点。 慢性乙型肝炎诊断标准参照《慢性乙型肝炎防治指南》、慢性丙型肝炎诊断标 准参照《丙型肝炎防治指南》、肝硬化诊断标准参考《病毒性肝炎防治方案》、SBP 诊断标准参照美国肝病研究协会制定的指南。 排除标准：6个月内曾补充过维生素D治疗的全部慢性肝病患者；SBP发生 前1个月内应用过口服选择性肠道杀菌剂诺氟沙星或其他抗生素、或腹腔穿刺术 前2周内应用抗生素治疗的肝硬化腹水患者。 2、主要试剂： RNAisoPlusTM Ex TaqTM实时定量PCR试剂盒(宝生物工程有限公司，大连，中国) VDR cDNA引物序列 LL．．37eDNA引物序列 GAPDHcDNA引物序列 R：5’．TGGTGAAGACGCCAGTGGA．3’ Cruz， SamaCruz，CA，USA) 罗丹明标记山羊抗小鼠IgG(中杉会桥生物技术有限公司，北京，中国) 科技有限公司，北京，中国) Hills，AZ，USA) 25．羟基维生素D检测试剂盒(IDS，Fountain 人LL一37 ELISA检测试剂盒(HyCult，Uden，Netherlands) 二、实验方法： 1、慢性肝病严重程度判断： 慢性肝炎病变程度判断：参考《病毒性肝炎防治方案》，将慢性肝炎病例分为 轻度、中度和重度。 肝硬化肝脏损害严重程度评估：参考Child—Pugh评分标准，肝硬化患者分为 A级、B级和C级；同时进行终术期肝病疾病模型(modelofend-stage Child．Pugh liver disease，MELD)评分。 2 2、维生素D状态参考标准： 根据慢性肝病患者血清250HD浓度，将其划分为维生素D充足、缺乏和不 口 ^匕o 3、血清及腹水上清250HD浓度测定： ELISA方法。 4、腹腔白细胞收集： 离心腹水，收集下层白细胞团块。 5、腹腔巨噬细胞分离纯化及纯度鉴定： 将腹腔白细胞贴壁培养2小时，去除未贴壁细胞，剩余细胞为腹腔巨噬细胞。 并经流式细胞仪检验CDIIb+CDl4+双阳性细胞为巨噬细胞。 6、腹腔巨噬细胞培养及药物干预： 将腹腔巨噬细胞于含5％胎牛血清的无酚红DMEM培养基中培养，分别给予 胞抗菌肽应答的调控。 7、巨噬细胞VDR及LL．37的表达： 应用real．time blot PCR方法检测VDR及LL．37mRNA表达；应用western 方法检测VDR蛋白表达，应用ELISA方法检测培养液上清LL．37浓度