分子遗传学 8章 基业尿操作技术及其应用.pptVIP

第八章 基因操作技术及其应用;一、重组DNA技术 ;??克隆(clone)---无性繁殖 ??分子克隆–DNA的无性繁殖技术 ??重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业二、重组DNA技术是基因工程的核心技术;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA)。 ;（1）获得目的基因； （2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子； （3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传； （4）对转化子筛选和鉴定； （5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。;（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中钓取目的基因。 （2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立全长cDNA文库或EST文库；从文库直接筛选所需基因。 （3）根据同源克隆等原理克隆需要的目的基因片段。 （4）直接化学合成。;(二)、限制酶的发现和应用则是DNA重组的关键;根据其来源命名。如： 属名 菌株名 E co R I 种名 编号 EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。;每种限制酶能识别和切割的通常4~8个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。（回文结构） ? 如：Hare III 5’-GGCC- 3’ ? 3’-CCGG- 5’ Bam HI 5’-GGATCC-3` 3’-CCTAGG-5’ 平末端(blunt end) 对称轴切，连接效果差 切割形式 粘性末端（sticky end）交错切;不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 Gene突变改变酶切位点的消失或新??生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 ;载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 ;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。;1、能自主复制；且插入外源DNA后，不影响其复制能力； 2、具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 3、有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 4、分子量小，以容纳较大的外源DNA； 5、具生物安全性。;1. 质粒 (plasmid);2. λ-噬菌体(λphage);3.柯斯质粒(cosmid vector)： 粘粒;4. 其他载体：大片段DNA克隆载体 ;（四）、外源DNA片断和载体的连接;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端;目的基因;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。;5′ 3′;4. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 ;人工接头及其应用;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;转染（infection）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。;（五）重组体的筛选 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)