茶多酚对HL-60细胞株体外增殖和细胞周期影响.pdfVIP

廷边大学医学院硕：}研究生毕业论文——实验材料 2，1．3主要仪器 (1)c02细胞培养箱：TC2323—2EUSA (2)超净工作台：1080—lI型上海净化设备厂 (3)酶联免疫检测仪：RT一2100C型美国 (4)电热干燥箱：HG一500型国产 (5)离心机：LD5—2A国产 (6)电子天平：国产 (7)倒置显微镜：Ix70一s82同本OLYMPuS (8)光学显微镜：同本0LYMPuS (10)FACS—Calibur型流式细胞仪：美国BectonDikinson公司 6 廷边大学医学院碗L研究生毕业论文——实验方法 2．2 实验方法 2．2．1细胞培养 液中，在37℃含5％C吼及饱和湿度的培养箱内培养。2—3天传代一次，倍增时问约 为24小时，传代培养至生长旺盛后，实验静24小时换液，全部实验均用进入对 数生长期的细胞。 2．2．2实验步骤 2．2．2．1细胞生长抑制测定 采用体外MTT法，即对数生长期细胞调整浓度至1×104／ml，加入96孔培养 板中。每孑L终体积为200肛1，每组平行3个复孑【r。将实验分为3组：A组：单用不 后孵育12、24、48小时后终止培养。每孔加入20≯l MTT溶液(5mg／m1)，37℃继 续孵育4小时后，弃孔内上清液体，加入150pl二甲基亚砜，振荡至溶解，用酶 标仪492咖波长处读取吸光度(A)值，计算细胞的抑制率。公式： 细胞抑制率=卜(实验样品A值一空白A值)／(对照样品A值一空白A值)×100％ ’ 2．2．2．2 细胞形态及凋亡检测 2．2．2．2．1实验分组： 对照组、茶多酚组、茶多酚+全反式维甲酸组，培养12、24、48小时。 2．2．2．2．2制片 调整细胞数为l×10’／ml，离心涂片于干燥洁净防脱片上，室温1：燥。 2．2．2．2．3HE染色 ①离心收集细胞，制成细胞涂片。 ②将经过处理的载波片用4％多聚甲醛固定30分钟后水沈15分钟，苏木素2 分钟，水沈2分钟，O．5％的蘸酸酒精30秒，水化15分钟，90％的乙醇1分钟，伊 红30秒，脱水、透明及封固。 2。2．2．2。4荧光染色 7 廷边大学医学院硕士研究生毕业论文——实验方法 普通光镜下观察各组细胞形念的变化，各组细胞离心后取loopl受捡细胞怂 液，加4Hl吖啶橙／溴化乙锭(A0／EB)混合染液，轻轻打匀后，取细胞悬液一滴 滴在洁净玻片上，加盖玻片后置激光共聚焦显微镜下观察细胞猁r：的形态。 2．2．2．2．5流式细胞仪测定细胞凋亡及细胞周期 ①取对数生长期细胞，调整细胞数为l×10。／m1。分手常对照组、茶多酚组、 茶多酚+全反式维甲酸组，加药后继续孵育12、24、48小时后终ll：培养。 ②收集细胞悬液以×looOrpm离心5分钟，弃上清液。 ③用PBs液沈涤细胞，离心弃上清液。 ④加入冰预冷的70％乙醇固定，4℃保存，过夜。 ⑤离心弃去固定液，用PBs液沈涤细胞，×l000rpm离心5分钟．弃上清液。 ⑥加入RNA酶500p1，轻轻吹打后，黄37℃，水浴30分钟。 ⑧再加入PI染液800pl混匀，置4℃避光l小时。． ⑨流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率、细胞周期，记录。 2．3数据的统计学处理 应用sPSSl3．O统计软件迸行多组问方差分析和卡方检验，实验所得数掘用均 数±标准差(x±S)的形式表示，P0．05时认为有显著性差异。茶多酚与全 反式维甲酸联用采用weed系数来判定两药之问的相互作用。预估效应C=A×B。A、 B指两药单用时各自的生存率。当两药合用时其实际生存率70％预估效应时， 两药有协同效应。 8 廷边大学医学院硕士研究生毕业论文——结 果