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来氟米特对糖尿病肾病大鼠肾脏VEGF表达影响[摘要] 目的:研究氟米特对糖尿病肾病大鼠肾脏血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:将48只清洁级雄性Wistar 大鼠随机分为正常对照组(A组)、模型对照组(B组)、来氟米特组(C组)和氯沙坦组(D组)。分别于糖尿病成模后8、12周处死,观察24 h尿蛋白排泄量、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、肾脏病理组织学改变、免疫荧光检测肾组织VEGF蛋白的表达,RT-PCR方法检测肾组织VEGF mRNA表达。结果:8、12周末糖尿病模型大鼠(B、C、D组)的Scr、BUN及 24 h尿蛋白较正常对照组(A组)均有显著增高(P 1.3标本收集与肾脏病理学检查 于8、12周末,收集大鼠24 h尿液,检测尿蛋白定量,称大鼠体重,心脏采血行肌酐、尿素氮检测。取血后,解剖所有实验大鼠,分离左肾,去包膜,称重。将左肾沿纵向切开,一半放入10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,常规切片,行PAS染色,光镜观察肾组织的病理变化。 1.4免疫荧光检测肾组织VEGF蛋白的表达 切片经过常规脱蜡、水化、组织抗原修复后,滴加5%BSA封闭液,室温 20 min后滴加兔抗大鼠 VEGF多克隆抗体,室温孵育60 min,PBS液冲洗;滴加山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗(1∶200) 37℃避光孵育1 h,PBS冲洗5 min×3次震摇;中性树胶封片;全自动多功能荧光显微镜观察阳性染色发绿色荧光。每张切片随机选 30个视野,用全自动图像分析系统(Iage2 roplus 6.0)分别计数其ID值,取其平均值。 1.5 肾组织VEGF mRNA表达的检测 取另一半左侧肾脏皮质区 100 mg组织作总RNA 提取,按照 RNAROSE REAGENT说明书步骤提取肾皮质总 RNA,参照 PrimeScript, RT-PCR Kit说明书进行逆转录。PCR反应条件为: 94℃变性5 min;94℃ 60 s,58℃ 60 s,72℃ 60 s 共 38 个循环,72℃延伸10 min。引物根据文献[4],由大连宝森公司设计合成,引物序列分别为,VEGF,上游: 5′-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3′,下游:5′-TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG-3′;产物200 kb;β-actin,上游: 5′CTCT GGTCGTACCACTGGCATTG-3′,下游:5′-CCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′,产物626 kb 。取5 μl扩增产物用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳图像分析系统分析各条带积分光密度值(OD),每组标本重复监测4次,以(VEGF/β-actin)×100 为VEGF mRNA 的相对值。 1.6统计学方法 所有数据均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,由 SPSS 13.0统计分析软件完成,以P 总之,VEGF在DN的发生及发展中起到一定的致病作用。本研究结果证实来氟米特对DN模型的VEGF表达具有一定的调节作用,可以减轻肾脏病变程度及延缓DN向终末期进展,但其具体作用机制有待于进一步研究。 [参考文献] [1] Bates DO,Harper SJ.Regulation of vascular permeability by vascular endothelial growth factors[J].Vascular Pharmacol,2002,39(4-5):225-237. [2] Amemiya T,Sasamura H,Mifune M,et al.Vascular endothelial growth factor activates MAP kinase and enhances collagen synthesis in human mesangial cells[J].kidney Int,1999,56(6):2055-2063. [3]Wu GJ, Wang H, YU L, et al. Immunosuppressive therapy for renal transplant recipients with cellcept, cyclosporine A and Prednisone[J].China Journal of Modern Medicine,2006,16(17):2640-2642. [4]Io H,Hamada C, Ro Y, et al. Morphology changes of peritoneum and expression of VEGF in encapsulated pe