性控精液对荷斯坦奶牛受胎率和后代生长发育影响论文.pdfVIP

河北农业人学硕士学位(毕业)论文 速率快于Y精子，通过适当的离心作用，将x和Y精予分开。 精液放在不同密度的12个Percoll梯度中，经过30分钟缓慢离心处理，最终可收集到90％以上 的X精子。但这种方法缺乏重复性以及在其他动物上的试验证实。 1．1．2．1．1．2电泳分离法此法是根据x精子和Y精子带有不同表面电荷的原理，力图将x、Y精 和Y精子。但此法缺乏可重复性。 1．1．2．1．1．3层流分离法此法是根据X和Y精子具有不同的运动方式或特点，将X和Y精子分 开。这种方法经Y特异探针检查证实是成功的，但仍须重复试验以及在其他动物进行试验加以证 实。 1．1．2．1．1．4自蛋白液柱分离法此方法是根据在黏滞的白蛋白液柱中，Y精子的游动速率比x 精子快的原理。White等人(1984)将羊精液放于牛血清白蛋白液柱顶部，然后收集液柱底部的精 子并给母羊授精，产出的24只羊羔中，75％为雄性№1；收集液柱顶部的精子并授精后，产出的22 Glass，1982；Zavos，1985)[71[S][91。 1．1．2．1．1．5上游法此法的根据是Y精子的游动速率快于x精子，其密度也比x精子低，在上游 液中停留时间比X精子长，故可在上游液中富集到Y精子。 此外，还有传递逆流电流法、Sephadex凝胶过滤法、称重法、形态大小分辨法等物理学方法。 1．1．2．1．2免疫学分离法此法是根据H—Y抗原在X精子和Y精子表面上存在差异，故利用H—Y抗体 检测精子质膜上存在的H-Y抗原，力图将X精子和Y精子分离开。据罗承浩等n伽报道，应用此法可 使奶牛提高10．7％的产母犊率。但由于免疫法对精子处理的时间较长，影响精子活力，导致受胎 率下降，因此该法目前还无法推J“应用。 1．1．2．1．3流动细胞检索分离法 目前认为最科学和最可靠的分离精子方法是根据x和Y精子的DNA含量存在差异的原理，利 用改良的流动细胞检索仪进行X和Y精子的分离。 1．1．2．1．3．1分离精子的理论基础 在哺乳动物中，每一个体的x精子和Y精子，其DNA含量都是恒定的。但x染色体的DNA含 论依据。 1．1．2．1．3．2分离精子的过程 根据哺乳动物X和Y精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行分离x和Y精 子的程序，包括将精子稀释并与荧光染料Hoechst 33342共同培养，这种染料则定量的与DNA结 合。当精子通过检索仪时被定位从而被激光束激发，由于X精子比Y精子的DNA含量多，结合的 荧光染料也多，所以X精子放射出较强的荧光信号。放射出的信号通过仪器和计算机系统扩增，分 2 性控精液对荷斯坦奶牛受胎率及后代生长发育的影响 析并分辨出哪些是X精子或是Y精子，或是分辨模糊的精子。当含有精子的缓冲液离开激光系统 时借助于颤动的流动室将垂直流下的液柱变成微小的液滴，平均每秒形成7万一8万个液滴，1／3 的液滴中包含一个X精子或Y精子，极少数液滴含两个或两个以上的精子。含有单个精子的液滴 被充上正电荷或负电荷，并借助两块各自带正电或负电的偏斜板，把X或Y精子分别引导到两个 收集管中。 在分离过程中排除死精子和受损的精子的方法是在精液中添加食用色素，死精子和细胞膜受 损的精子将被染色，而细胞膜完整的精子能排除食用色素，被食用色素染色的死精子和受损的精 子用Hoechst33342染色后，会由于荧光减弱而在分离过程中被排除。 由于目前技术条件的限制，只有30％左右的精子通过流式细胞分离仪时能够准确地根据其 荧光量大小而得到分离。残留在染色样品管中和校正喷嘴过程中丢失22％，定向不正确、信号重 叠或死亡的精子占43％，分离液滴飞溅出收集管外的、离心时残留在上清液中和装管过程丢失、 残留的精子约为5％，最终只分离到30％的精子，其中x和Y精子各占15％。 1．1．2．1．3．3分离精子的效率与纯度 小时只能分离x和Y精子各36万个，到现在约各为1100万个。从分析纯度看，(WelchandJohnson， 仪对水牛精子进行分析，X和Y精子的分离纯度分别为94％和89％。 1．1．2．1．3．4分离对精子的影响 在评估流式细胞仪分离精子过程中分离加压、H33342染色和激光照射对牛精予活力的影响时发 现，分离加压对精子造成的损伤最大，精子活力下降18．6％；在分离加压的同时进行激光照射， 29．3％；而且不同种公牛的精子对分离过程各项操作的敏感性存在明显差异。