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Bmi1基因及其编码蛋白在SKM1细胞系中表达 　【摘要】 目的 探讨人类Blymphoma MoMLV insertion region（Bmi1）基因及其编码蛋白在骨髓增生异常综合征（myelodysplasia syndrome，MDS）发病中的地位和作用。 方法 以正常骨髓和白血病细胞系K562为对照，利用半定量RTPCR和Western Blot 研究 MDS细胞系SKM1中Bmi1基因在mRNA和蛋白水平的改变。结果 SKM1中Bmi1在mRNA和蛋白水平均较正常组织有明显表达（Plt;0.05），二者表达水平与K562细胞系无显著差异（Pgt;0.05）。结论 Bmi1基因在MDS亚型RAEB细胞系SKM1中有明显表达，其在RAEB发病中可能具有重要意义。 【关键词】 Bmi1 MDS SKM1 论文代写 　　0 引言 　　Bmi1是 Polycomb家族成员，其最初发现是作为一种原癌基因与另一种癌基因cmyc共同导致B细胞淋巴瘤的发病。近年来研究发现，该基因对于维持干细胞及肿瘤干细胞的自我更新，进而维持干细胞池的大小具有重要意义。骨髓增生异常综合征（MDS）是一种干细胞水平的恶性血液疾病，Bmi1在MDS中的表达国内外尚无相关研究。我们通过研究Bmi1在MDS细胞系SKM1中的表达水平，初步探讨了Bmi1在MDS发病中的作用，以期为进一步指导临床 治疗 提供新的思路。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要材料 　　Bmi1单克隆抗体（Santa Cruz产品），二抗（HRP标记羊抗鼠IgG,晶美），K562细胞系（本室保存），SKM1细胞系（JCRB0118，Kawaguchi.R）,蛋白标准品（Sigama），ECL发光试剂盒、一步法RTPCR试剂盒（晶美），BeyozolRNA抽提试剂盒、硝酸纤维素膜（展晨），Bmi1,GAPDH引物均由上海生工合成，显影液、定影液（晶美）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 细胞培养 　　SKM1、K562细胞系培养传代，每周半量换液，培养条件为含10%小牛血清的RPMI1640，37℃，5% CO2。 　　1.2.2 正常对照 　　取正常人骨髓，常规分离单个核细胞备用。 毕业论文 　　1.2.3 RTPCR 　　（１）收集细胞：取对数生长期的细胞，按1×107浓度制备细胞悬液，1 000r/min离心3min，去上清，1×PBS洗涤沉淀1次;（２）提取RNA按Beoyozol试剂盒说明提取总RNA，取少量琼脂糖凝胶电泳测试RNA完整性;（３）一步法RTPCR 按试剂盒说明进行。反应体系：5×buffer 10μl,25mmol/L MgCl2 2μl,dNTP各2μl，Taq酶2μl，模板1.5μl，p1、p2(5pmol/μl)各1μl，DEPC处理ddH2O水补足50μl，混匀，离心。反应条件：逆转录60℃ 30min;预变性95℃ 5min；变性95℃ 1min，退火54℃ 1min,延伸72℃ 1min，进行25个循环，最后72℃延伸10min。结束后，取产物5μl, 1%琼脂糖凝胶电泳（80V，10min），灰度扫描。 　　Bmi1引物序列：p1: 5CTG GTTGCCCATTGACAGC3’; p2: 5’CAGAAAATGAATGCGAGCCA3’,片段长度为70bp。 　　GAPDH引物序列：p3: 5CCATGGAGAAGGCTGGGG3’; p4: 5’CAAAGTTGTCATGGATGA CC3’,片段长度为199bp。扩增条件见 文献 ［1］。 论文代写 　　　1.2.4 Western Blot 　　常规提取蛋白， Bradford法蛋白定量， 蛋白电泳， 电转膜（80mA恒流电20h）， 0.01M PBS洗膜3次， 8%脱脂奶粉室温封闭2h， 加入一抗（1∶1 000）， 4℃过夜， 洗膜3次， 加入二抗（1∶1 000）, 37℃孵育1h， 洗膜3次， 按ECL发光试剂盒说明操作， 显影， 定影， 冲洗， 晾干， 灰度扫描。 论文代写 　　1.2.5 统计学 分析 　　KS400图像系统进行灰度分析，结果以±s表示，统计学处理采用oneway anova(SPSS10.0)。 　　2 结果 论文代写 　　2.1 Bmi1 mRNA在MDS细胞系SKM1中的表达 　　Bmi1 mRNA/GAPDH mRNA表达灰度比值（±s）在正常骨髓单个核细胞以及白血病细胞系K562，MDS细胞系SKM1中分别为0.984±0.112，4.406±0.163，4.