CIK及DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤.docVIP

CIK及DC细胞联合治疗145例晚期恶性实体瘤 　【摘要】 目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（DC）联合治疗晚期肿瘤。方法从外周血分离单个核细胞，体外经GMCSF和白细胞介素4(IL4)诱导产生DC细胞，淋巴细胞经干扰素γ（IFNγ）、IL2、CD3单抗和IL1α体外诱导产生CIK细胞，采用流式细胞术检测CIK的表型，并回输患者进行治疗，至少接受3次治疗。结果82例可评价病灶的患者中，3例完全缓解（CR），7例部分缓解（PR）；31例不可评价病灶的患者中，7例患者胸腹水消失，与治疗前相比，治疗后患者CD3+和 CD8+明显升高（Plt;0.05）。结论CIK细胞治疗晚期恶性实体瘤有一定的临床疗效，为该类患者的治疗提供一种有效的免疫治疗手段。 【关键词】 杀伤细胞 树突细胞 细胞 培养的 免疫疗法 肿瘤 细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer,CIK）是以CD3+CD56+T细胞为主要效应细胞的异质细胞群，具有增殖快、杀瘤活性高、杀瘤谱广等优点。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，是唯一能激活幼稚T细胞的抗原递呈细胞。DC与CIK共培养可促进CIK的增殖，并加强其功能[12]。为此，本单位自2003年10月～2005年10月将CIK细胞与DC细胞共培养用于145例晚期恶性实体肿瘤患者的治疗，取得较好的近期疗效，现将临床观察结果报告如下。 1对象和方法 1.1对象145例恶性实体瘤患者均经病理证实，男性99例，女性46例，中位年龄52岁（21～83岁）；其中胃癌25例，结直肠癌15例，肝癌、肺癌各20例，鼻咽癌12例，食管癌10例，非何杰金淋巴瘤、乳腺癌、恶性黑色素瘤及肾癌各5例，脑瘤4例，精原细胞瘤及前列腺癌各3例，胸腺瘤、胰腺癌、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤及卵巢癌各2例，宫颈癌1例。 按TNM国际分期法：Ⅲ期88例，Ⅳ期57例；82例有可测量病灶，31例有不可测量病灶（包括胸水和腹水），32例为术后患者；Karnofsky评分≥60分，预计生存期gt;3个月；治疗前心、肝、肾功能及血常规大致正常；采血前1个月及治疗期间均未接受过放、化疗。 1.2主要试剂Ficoll淋巴分离液（北京军事医学科学院）；鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD56（美国Coulter公司）；rhIL4（英国Pepro Tech公司）；肿瘤坏死因子(TNFα，上海赛达生物药业有限公司)；CD3McAb（武汉生物制品研究所）；干扰素(IFNγ，上海克隆公司)；rhIL2（北京瑞德合通药业有限公司）；GMCSF（北京联合药业有限公司）；RPMI 1640、无血清培养基AIMV（美国Gibco公司）。 1.3肿瘤抗原来源于患者自身手术标本或肿瘤细胞系经超声波粉碎后，10 000 r/min离心×20 min，收集上清为肿瘤组织/细胞裂解物。 1.4方法 1.4.1CIK细胞的制备参照文献[3]。新鲜分离的患者抗凝外周全血100 mL，经Ficoll淋巴分离液梯度离心（500 r/min×15 min），取界面层单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMNC），用RPMI1640培养液悬浮细胞，离心（600 r/min×10 min），洗涤细胞3次后，细胞数约为106，用AIMV无血清培养基调整细胞密度为（4～6）×106 mL-1，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养2 h。收集非贴壁细胞，用含人AB血清的完全培养基调整细胞密度约为1×106 mL-1，加入IFNγ 1 000 U/mL，24 h后加入rhIL2 300 U/mL，CD3McAb 70 ng/mL，IL1 10 U/mL，每3 d换液1次，同时补加rhIL2 100 U/mL。 1.4.2DC细胞的培养参照文献[4]。在1.2.3获得的贴壁的PBMNC细胞中加入含GMCSF 1 000 U／mL、rhIL4 1 000 U／mL的AIMV培养基，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2中培养，每3 d换液1次。第3 d将肿瘤抗原加入DC培养液内，第5 d加入TNFα 1 000 U／mL，第7 d将部分负载后的DC按1∶5的比例加入CIK培养液中，共培养5～7 d。 1.4.3细胞增殖动态观察细胞增殖，采用标准白细胞计数方法，计算每毫升中的细胞总数。 1.4.4细胞表型测定收集培养第1 d和第12 d的CIK细胞，PBS洗涤细胞2次，使用不同的抗体组合标记细胞，这些抗体组合为：CD3CY5，CD8PE和CD3FITC，CD56PE，室温孵育20 min后，PBS洗涤细