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HPV18E2蛋白CTL表位多肽构建及表达 　【摘要】 目的 分析HPV18E2蛋白的CTL表位，合成并纯化这些表位多肽，构建表达HPV18E2蛋白的靶细胞，检验特异性CTL对靶细胞的杀伤效果，为进一步研制人乳头瘤病毒18型(HPV18)基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒(pBR322HPV18)为模板，利用PCR方法扩增HPV18E2 DNA片段，将HPV18E2 DNA与加强绿色荧光质粒(pIRES2EGFP)重组构建重组质粒(pIRES2HPV18E2EGFP)。用酶切电泳及测序检查质粒重组后序列正确性。重组质粒转染Hela细胞。51Cr释放实验评估CTL杀伤能力。结果 克隆重组质粒pIRES2HPV18E2EGFP酶切后显示的酶切图谱与预期相同，而且测序验证插入片段全序列无改变。转染并用G418筛选后，在荧光显微镜下可见绿色荧光细胞的表达。三条候选多肽特异性杀伤能力分别为60.00%、71.29%和80.00%。结论 三条备选肽段都具有明显的杀伤效应，均为HPV18E2蛋白的有效CTL表位。 【关键词】 人乳头瘤病毒18型；E2基因；多肽 　　Construction and expression of recombinant plasmid pIRES2HPV18EGFP Abstract: Objective To analyse the function of epitopespecifical HPV18E2 CTL. Methods The E2 gene of HPV18 was amplified by PCR from pBR322HPV18 and cloned into pIRES2EGFP. The sequence of cloned HPV18E2 was confirmed by restriction analysis and DNA sequencing. Then transfected into HeLa cells. The functional analysis is valued by 51Crrelease assay. Results HPV18 E2 gene fragment was amplified by PCR and ligated to pIRES2EGFP, then transfected into HeLa cells successfully. The expression of green fluorescence cells was observed by fluorescence microscopy. The specific lysis of the cells from the three peptides was 60.00%, 71.29% and 80.00%. Conclusion The three peptides have the ability to active epitopespecifical CTL. Based on them, a new peptides vaccine maybe constructed. Keywords: human papillomavirus type18; E2 gene; polypeptide 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。宫颈癌的发生可能与性生活紊乱，过早性生活，早年分娩，多产，地理环境等因素有关。分子生物学研究结果显示90%以上的宫颈癌伴有人乳头瘤病毒(HPV)感染。宫颈癌以鳞状细胞癌最为多见，其次为腺癌和腺鳞癌等。高危型HPV的感染是诱发宫颈癌的必要条件，尤其是HPV16型和18型。E2是一种反式激活蛋白，涉及病毒DNA转录的反式激活，能延缓染色体有丝分裂的进程，具有抑制癌细胞生长的功能。本实验是以加强绿色荧光质粒pIRES2EGFP为载体，构建了HPV18E2蛋白的真核表达质粒pIRES2HPV18E2EGFP，为制作宫颈上皮内瘤变的治疗性多肽疫苗打下基础。 1 材料与方法 1.1 材料 菌株：E.coli DH5 (由本实验室保存)。质粒：①pBR322/HPV18，含目的基因的重组质粒，由德国癌症研究中心EM de Villiers教授惠赠；②pIRES2EGFP：含绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体，Clontech公司，由Professor Roger Y. Tsien（University of California, San Diego, U.S.A）惠赠，含有Kan+抗性基因。HeLa细胞株，购自协和医科大学基础医学研究所。主要试剂：pfu高保真DNA聚合酶(上海生物工程公司)；质粒抽提试剂盒(Omeg