MMP-2及宫颈癌侵袭转移相关性探究.docVIP

MMP-2及宫颈癌侵袭转移相关性探究 　摘　要：目的：探讨基质金属蛋白酶-2（MMP-2）在宫颈癌组织中的表达及其与肿瘤局部血管生成和淋巴结转移的相关性。方法：采用荧光定量PCR法检测58例宫颈癌组织（30例伴有淋巴结转移，28例无淋巴结转移）中MMP-2 mRNA表达水平；用CD105标记新生血管内皮细胞，计算肿瘤内微血管密度（Microvascular density，MVD）。结果：宫颈癌组织内MMP-2 mRNA的表达水平在淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组（P＜0.01）；且其表达与MVD正相关。结论：MMP-2在宫颈癌血管生成和侵袭转移中发挥重要作用。 关键词：宫颈癌；基质金属蛋白酶-2；血管生成；侵袭转移 前期研究发现，环氧化酶-2（COX-2）在宫颈癌局部血管生成及肿瘤侵袭、转移中扮演重要角色。已有的研究表明，肿瘤组织中COX-2表达与MMP-2水平呈正相关，高表达的COX-2蛋白可增强MMP-2的表达及活性，且COX-2通路被阻断时，MMP-2的生物学功能亦受到抑制，提示COX-2可能通过MMP-2进而发挥生物学功能[1]。因此，研究将进一步探讨MMP-2与宫颈癌局部血管生成及肿瘤侵袭转移的相关性，旨在探讨COX-2调控宫颈癌侵袭转移的具体机制，亦为临床评估宫颈癌恶性程度及预后提供相关资料和依据。 1 资料与方法 1.1 一般资料：选取2009年1月～2011年5月本院行手术切除并经病理组织学证实的宫颈癌患者58例， 年龄35～67岁，平均53.6岁。肿瘤分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化15例；FIGO临床分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期34例；淋巴结转移：未见淋巴结转移28例，有淋巴结转移30例。 1.2 CD105免疫组织化学染色及MVD计算：①采用免疫组织化学SP法，石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，过氧化酶阻断剂室温孵育10 min以阻断内源性过氧化酶的活性，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，微波抗原热修复。滴加正常山羊血清封闭组织内非特异性抗原，37℃恒温水浴锅孵育20 min后弃去血清，加入CD105单克隆抗体（1:200，Santa Cruz），4℃湿盒内过夜，PBS冲洗。滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS冲洗。滴加辣根过氧物酶标记链霉卵白素，37℃孵育20 min，PBS冲洗，AEC显色，水性树胶封片。用PBS代替第一抗体作为阴性对照；②任何染成玫瑰红的内皮细胞或与邻近微血管、肿瘤细胞之间存在明显分离的内皮细胞团，均按独立的微血管分别记数，是否有血管腔不作为记数微血管的必要条件，分支血管结构只要不相连也视为另一个微血管，但血管腔大于8个红细胞面积或血管周围有平滑肌包绕的较大血管不纳入记数范围。先在低倍视野下找肿瘤组织内微血管密度最高的区域，然后在200倍视野下计数微血管3个视野的数目，再将总数除以3，取其平均值作为该肿瘤高倍视野下的MVD。 毕业论文 1.3 荧光定量PCR：①试剂与引物，组织RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司，逆转录及荧光定量PCR试剂均购自北京全式金生物技术有限公司（TrasScript First-St rand CDNASynthesis SuperMix，TrasScript Green qPCR SuperMixUDG）。MMP-2引物序列（411bp）上游：5’-CGT TTG ATG GCA AGG ATG GAC -3’，下游：5’-GCC ATC AGC GTT CCC ATA CTT TAC-3’，内参序列 GAPDH（251 bp）：上游5’-CCA TGT TCG TCA TGG GTG TGA ACC A-3’；下游5’-GCC AGT AGA GGC AGG GAT GAT GTT C-3’。引物均委托上海生工公司合成；②在无菌无RNA酶条件下严格按照说明书提取RNA，行琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性，取完整性较好（琼脂糖凝胶上28SRNA条带亮度为18SrRNA两倍）的RNA在紫外分光光度计（ND2000）行RNA纯度测定；取A260/280值在1.9～2.1之间的RNA在PCR仪器（Bio-Rad，S1000）行逆转录合成cDNA；采用Roche荧光PCR仪（LightCycler 480Ⅱ）及其分析软件行PCR 扩增及定量分析。25 μl反应体系含cDNA 3 μl，上下游引物各0.4 μl，Mix：12.5 μl，Passive ReferenceDye 0.5 μl，加水至25 μl。PCR 循环：50℃ 2 min， 95 ℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共45个循环。每次扩增均设内参基因组和目的基因组以及2管空白对照组（由DEPC水代cDNA）。每一样本均设2