PLGA-蒿属花粉纳米疫苗对小鼠过敏性哮喘治疗作用及机制实验研.docVIP

PLGA-蒿属花粉纳米疫苗对小鼠过敏性哮喘治疗作用及机制实验研 　作者：刘玉琳，杨慧，余克花，刘志刚，崔晓民 【摘要】 目的研究以聚乳酸-羟基乙酸共聚物 [poly(D，L-lactic-co-glycolic)acid，PLGA]为佐剂制备的蒿属花粉纳米疫苗对小鼠过敏性哮喘模型气道炎症治疗的疗效, 并探讨其免疫治疗机制。方法40只小鼠随机分为5组：对照组、模型组、空白粒子治疗组(治疗A组)、蒿属花粉粗浸液治疗组(治疗B组)、PLGA -蒿属花粉治疗组(治疗C组)。用蒿属花粉建立哮喘模型。对照组用生理盐水代替致敏。ELISA法检测各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)和脾细胞培养上清液(SCCS)中IL-4，IFN-γ的含量;收集BALF进行总细胞计数和嗜酸性粒细胞计数;HE染色观察各组小鼠肺组织病理变化。结果肺部组织学和BALF中细胞计数结果显示，与模型组相比，B、C组的肺部嗜酸性粒细胞浸润显著减轻，BALF中总细胞和嗜酸性细胞显著减少;细胞因子的测定结果显示，在BALF中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为(88.71±6.82) pg/ml和(24.14±2.91) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组(40.07±2.42) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 38.31±6.28) pg/ml的IL-4显著降低( Plt;0.01);PLGA-蒿属花粉治疗组( 63.69±8.0) pg/ml的IFN-γ显著升高(Plt;0.01);在SCCS中，模型组的IL-4和IFN-γ分别为( 81.02±12.5) pg/ml和( 34.12±4.64) pg/ml，与之相比，蒿属花粉粗浸液治疗组( 58.91±9.10) pg/ml和PLGA-蒿属花粉治疗组( 41.30±4.75) pg/ml的IL-4分泌显著减少( Plt;0.01) ;PLGA-蒿属花粉治疗组(82.50±5.63) pg/ml的IFN-γ显著增高(Plt;0.01)。结论PLGA -蒿属花粉纳米疫苗免疫治疗小鼠哮喘有良好疗效。其机制可能与调节Th1/Th2平衡有关。 【关键词】 聚乳酸-羟基乙酸共聚物; 哮喘; 蒿属花粉; 纳米粒子; 免疫治疗 过敏性疾病是目前世界性重大卫生问题之一，常见的有过敏性哮喘和过敏性鼻炎等。哮喘是一种以肺部嗜酸粒细胞浸润和对各种激发因子产生气道高反应为特征的慢性气道炎性疾病，是一种常见病和多发病，且发病率有逐年上升的趋势[1，2]。目前认为，哮喘的发生与机体的Th1/Th2免疫功能失衡有关，哮喘患者体内T细胞趋向于产生高水平的Th2细胞因子(IL-4、IL-5等)，而Th1细胞因子(IFN-γ)水平相对较低[3]。 　　聚乳酸-羟基乙酸共聚物( PLGA) 是一种生物相容性良好的可降解材料[4]，可促进变应原直接被抗原呈递细胞吸收，在生物体内缓慢释放变应原。Scholl等[5]的实验证实，用PLGA包裹变应原可有效地诱导抗体IgG的产生，但PLGA -蒿属花粉纳米疫苗在治疗小鼠哮喘的作用目前未见相关报道。本实验通过物理方法制备包裹蒿属花粉变应原的PLGA纳米疫苗, 研究该疫苗对蒿属花粉变应原诱导的小鼠哮喘的免疫保护作用, 并探讨其作用机制。 　　1 材料 　　动物选用健康Balb/C小鼠40只，4～6周龄，雌雄不限，体质量(18±2)g。 　　2 方法 　　2.1 蒿属花粉变应原的制备按杨慧等[6]的方法进行。 　　2.2 PLGA -蒿属花粉纳米粒子的制备采用超声乳化法，以PLGA为包裹材料，制备PLGA-蒿属花粉纳米粒子。将50 mg的PLGA溶于1 ml的二氯甲烷中，再加入蒿属花粉变应原100 μl，混旋1 min，超声乳化30 s，再加入2%的聚乙烯醇(PVA)2 ml，混旋1 min，超声乳化30 s，最后将上述溶液滴入正在搅拌状态的50 ml的双蒸水中，使之迅速分散，低速搅拌4 h，以挥发有机溶剂。扫描电镜观察粒子形态和大小，BCA蛋白质定量法测定纳米粒子载药量。 　　2.3 小鼠哮喘模型的建立和免疫治疗40只小鼠随机分为5组：对照组、模型组、治疗A组(空白粒子组)、治疗B组(蒿属花粉粗浸液组)、治疗C组(PLGA -蒿属花粉治疗组)。第1天，模型组和治疗组小鼠腹腔注射(i.p.)致敏液[1 mg Al(OH)3+10 μg蒿属花粉变应原]后，治疗组分别用空白粒子、蒿属花粉粗浸液、纳米粒子-蒿属花粉s.c.进行免疫治疗。第8，15，22天再次用相同的致敏液致敏，处死小鼠的前3 d给予0.2%变应原浸液滴鼻(i.n.)，连续3 d，1次/d，诱发哮喘发作。对照组用生理盐水代替致敏。 　　2.4 实验动物的处死及标本采集颈椎脱臼法处死小鼠，气管插管，用预冷的PBS进行肺泡灌洗，每次注入PBS液0.8 m