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不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累影响 　【摘要】 　　目的研究不同培养基成分对金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累规律的影响。方法改变培养基中碳源、氮源、磷酸盐、钙盐的浓度，比色法测定愈伤组织中皂苷的含量。结果金铁锁愈伤组织生长和皂苷积累的最适培养基成分为蔗糖40 g·L-1，KNO3∶NH4NO3为（1.9：1.65）g·L-1，1 mmol·L-1KH2PO4，4.5 mmol·L-1CaCl2。结论蔗糖作为碳源最有利于金铁锁愈伤组织生物量的积累和金铁锁皂苷的生物合成。混合氮源有利于金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量的积累。 【关键词】 金铁锁； 愈伤组织； 皂苷含量； 培养基成分 　　金铁锁Psammosilenet unicoides W.C Wu et C.Y Wu是石竹科金铁锁属单种属植物，其根入药，用于跌打损伤、胃痛、风湿痛、创伤出血等的治疗［1］，是我国中成药保密品种“云南白药”的重要成分之一。金铁锁化学成分主要为三萜皂苷及环肽类化合物［2，3］。研究称金铁锁皂苷在抗炎镇痛作用中效果显著［4］。近年来，由于自然生长慢、滥采滥挖、环境恶化、市场需求增加等多方面原因，造成金铁锁资源数量急剧下降，成为《中国植物红皮书》中的国家二级重点保护的珍稀濒危物种［5，6］。而利用组织培养技术生产金铁锁的替代产品，即可满足市场的需求也是保护野生种质资源必由之路，成为解决金铁锁药用资源匮乏问题的重要手段之一。 　　目前，对金铁锁皂苷类物质的研究主要集中在其药理药效方向，对金铁锁愈伤组织培养过程中次生代谢产物调控的研究目前尚未见报道。本实验通过改变不同培养基成分，研究金铁锁愈伤组织生长及皂苷积累的规律，以期为利用组织培养技术规模化生产金铁锁皂苷类物质提供理论依据。 　　1 材料 　　选取大连工业大学细胞工程实验室盆栽金铁锁幼嫩茎为外植体。 　　2 方法 　　2.1 愈伤组织诱导与培养外植体经流水冲洗后用Tween20浸泡25 min，冲洗3次，0.1%HgCl2处理8 min，无菌水洗3次，经75%乙醇处理8 s，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干水分，然后切成1～1.5 cm的茎段进行接种。所用诱导培养基为MS固体培养基（2,4-D 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 m·L-1+3%蔗糖+0.8%琼脂，pH 5.8），(25±1 ) ℃下暗培养。外植体接种6 d左右，切口处开始膨胀；10 d左右开始长出乳白色愈伤组织；20 d左右愈伤组织逐渐覆盖外植体，在25 d时挑选质地松散、生长良好的愈伤组织，称重后继代培养，25 d后收获称重。 　　2.2 金铁锁愈伤组织测量指标 　　干重增量=最终收获干重－接种干重量 　　金铁锁皂苷产量=干重增量×金铁锁皂苷含量 　　鲜重称量：从培养瓶中取出愈伤组织，用滤纸吸净其表面水分后称重。干重称量：将收获的愈伤组织置于50℃下干燥至恒重。实验重复3次取平均值。 　　2.3 金铁锁皂苷含量测定 　　2.3.1 金铁锁皂苷的提取 将获得的愈伤组织干燥粉碎并准确称取2.00 g，加入20倍量80%乙醇超声波（频率：40 kHz,功率：500W）提取100 min，过滤得醇提液，挥干试剂得醇提物。将此醇提物用适量水溶解，用正丁醇（4∶3∶3）萃取3次。正丁醇萃取液蒸发至干，用甲醇溶解并定容至10 ml，得金铁锁皂苷提取液。 　　2.3.2 金铁锁皂苷含量的测定 目前国内尚无金铁锁皂苷类成分的法定对照品，本实验选择人参皂苷Re为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法测定金铁锁总苷含量。 　　对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Re标准品5 mg，加甲醇10 ml，振荡，摇匀，待用。 　　标准曲线的绘制：分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml人参皂苷Re对照液置于具塞试管中，水浴挥干试剂，加入5%香草醛-高氯酸溶液0.2 ml和高氯酸0.8 ml，65℃下水浴20 min ,立即用冰水冷却至常温，加入5 ml冰醋酸，摇匀静置后于λ=540 nm下测定吸光度，以样品浓度为横坐标，吸光度纵坐标，绘制标准曲线。以此方法得回归方程为：A=1.628 3C-0.002 3，r=0.999 1。 　　金铁锁皂苷含量测定：精取金铁锁皂苷提取液0.5 ml，置于具塞试管中，按标准曲线操作。用回归方程计算金铁锁皂苷的含量，折算成愈伤组织中的含量和每升培养基的产量。 　　　3 结果 　　3.1 不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响 由表1可知，蔗糖作为碳源对金铁锁愈伤组织的生长及皂苷积累影响作用最为显著。白砂糖影响效果次于蔗糖，但明显高于麦芽糖和葡萄糖。表1 不同碳源对金铁锁愈伤组织生长及皂苷含量积累的影响（略） 　　3.2 不同蔗糖浓度对金铁锁愈伤组织生长和皂苷含量积