丙酸氟替卡松对哮喘小鼠气道重塑及TGFβ1表达影响.docVIP

丙酸氟替卡松对哮喘小鼠气道重塑及TGFβ1表达影响 　【关键词】 丙酸氟替卡松； 哮喘；气道重塑；转化生长因子β；小鼠 　　近年来越来越多的研究证据表明,支气管哮喘除了存在气道炎症和非特异性气道高反应性外，亦存在气道重塑，组织学呈现上皮细胞增生、上皮下胶原沉积和纤维化，以及平滑肌细胞增生肥大的异质性改变,引起气道壁厚度的增加，导致气流的不可逆性阻塞和气道的持续性高反应［1］. 现普遍认为气道重塑是炎症所造成组织损伤后不完全或过度修复所致［2］. 糖皮质激素是目前控制哮喘最为有效的抗炎药物，但对气道重塑的作用目前相关的研究报道较少［3-4］. 本研究利用哮喘小鼠气道重塑模型，观察早期应用丙酸氟替卡松后，气道壁管壁厚度、平滑肌厚度以及TGFβ1表达的变化，进一步探讨其对气道重塑的影响和可能的作用机制. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　Balb/c小鼠30只，雄性，体质量(20±2)g，第四军医大学实验动物中心提供. 鸡卵白蛋白(ovalbumin ，OVA) ，丙酸氟替卡松干粉（美国Sigma公司）；TGFβ1兔抗小鼠多克隆抗体（北京中山生物工程有限公司）；链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物(strept avidinbiotion complex,SABC)免疫组化检测试剂盒（北京中山生物技术有限公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1动物分组和模型的建立 　　雄性小鼠30只，随机分为哮喘组(A组)，正常对照组(B组)，丙酸氟替卡松治疗组(C组)，每组动物10只. 参照文献［5］的方法，A组：第l日腹腔注射OVA氢氧化铝混悬液0.2 mL (内含OVA 10 μg及氢氧化铝20 μg)，第l5日重复致敏1次，自第22日开始予以25 g/L OVA生理盐水溶液雾化吸入，每日1次，每次30 min，持续4 wk. B组：用生理盐水以同样方法致敏并雾化吸入. C组：致敏及OVA雾化程序同A组，从第1次激发起，每日激发前30 min吸入丙酸氟替卡松，浓度为0.17 g/L（10 mgFP加入60 mL生理盐水），每次吸入时间10 min，持续4 wk. 　　1.2.2肺组织病理切片制备 　　各组小鼠在末次雾化吸入24 h后离断颈椎处死，常规留取小鼠右肺中叶，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，梯度脱水、石蜡包埋、石蜡切片厚度3～5 μm，部分切片经苏木精伊红(HE)染色并行病理学观察，部分进行免疫组化染色. 　　1.2.3免疫组化SABC法 　　石蜡切片脱蜡至水，30 g/L过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，微波加热行抗原修复处理，滴加一抗兔抗鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗生物素化山羊抗兔IgG(1∶200)， DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，阴性对照以磷酸盐缓冲液代替一抗而其它条件均相同. 　　1.2.4定量及计算机图像分析 　　参照文献［6］的方法，将待测切片放在连接计算机的显微镜下放大400倍，找到完整的肺内支气管横断面，每只动物切片随机选取直径100～200 μm完整的小支气管横截面5个，采用leikaQ500分析系统测定支气管基底膜周径(basement membrane perimeter, Pbm)，总管壁面积(airway wall area, WAt)，平滑肌面积(smooth muscle area, WAm)，并用Pbm将测量值标准化，分别以WAt/Pbm，WAm/Pbm表示，代表相应管壁层的厚度. 免疫组化染色后以图像分析系统测定各气道的灰度值(蛋白含量高则灰度值低)，每只动物取5个小气道，平均后作为该标本的灰度值. 统计学处理： 采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，实验数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，组间差别采用LSDt检验. 　　2结果 　　2.1肺组织病理学改变光镜下观察结果显示，A组气道壁及气道平滑肌明显增厚，黏膜下层增宽，黏膜皱褶增多，管腔狭窄，有时可见黏液栓堵塞，气道上皮细胞脱落，杯状细胞增多，黏膜下及管周有大量炎性细胞浸润. C组上述改变较A组明显减轻(图1). 　　2.2气道形态学测定图像分析 　　图像分析结果显示WAt/Pbm: A组（17.43±1.10）μm2/μm，B组(11.52±1.76) μm2/μm,C组(14.06±1.20) μm2/μm,A组与B组比较,C组与A组比较组间差异具有统计学意义（Plt;0.01）. ＷAm/Ｐbm: A组（6.58±1.16）μm2/μm，B组 (3.42±0.75) μm2/μm,C组 (4.41±1.00) μm2/μm,A组与B组比较,C组与A组比较组间差异具有统计学意义（Plt;0.01）. 　　　2.3气道壁TGFβ1表达的变化 　　TGFβ1免疫组化染色显示，三组小