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中草药鉴定种特异性DNA探针筛选方法 　【摘要】 　　基因芯片技术为中草药高效、并行、快速鉴定提供了可能。而中草药种特异性探针的筛选是中草药基因芯片鉴定技术开发的关健。文章结合当今中药鉴别芯片和其它物种鉴定芯片研究进展总结了几种适合中草药特异性探针筛选的方法。 【关键词】 基因芯片； 中草药鉴别； 种特异； DNA探针 　　Abstract:DNA chip technology makes it feasible to identify Chinese herbal medicine rapidly, efficiently and in parallel. The screening of species-specific DNA probes from medicinal plants is the key step in developing DNA chip for the authentication of Chinese herbal medicines. Combined with current DNA chip researches on identification of herbal plants or other species, some methods available for the screening of medicinal plants’ species-specific DNA probes were summarized in this paper. 　　Key words：DNA chip; Herbal medicine; Species-specific DNA Probe 在中药材基因鉴别和特征性基因测序的基础上，建立以基因诊断和基因芯片为载体的中药材分子鉴别技术和方法是今后中药生物技术研究中的努力方向之一［1］。中药鉴定的基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印手段，将中药种特异性DNA探针固定在玻璃片、尼龙膜或其它支持物表面上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG标记待检中药基因组DNA样本杂交，通过检测杂交信号来实现对中药的准确、并行、高效地检测。虽然DNA芯片技术已广泛应用于DNA测序［2］、单核苷酸多态性分析［3］、基因表达分析［4］、基因诊断［5］、药物筛选［6］、微生物种类鉴定等［7］各个方面，但应用于中药鉴定尚处于起步阶段，近年来随着基因芯片技术的广泛应用，国内外一些研究机构已开始研究使用基因芯片对中药(材)进行鉴别［8，9］。采用基因芯片技术鉴定中药的基本过程是［10］：①应用分子生物学技术找出待鉴定中药的特定寡核苷酸序列；②以此寡核苷酸序列作为探针，装配到芯片上；③检测样品（DNA）的提取、扩增和标记；④杂交检测及结果分析。其中找出待定中药的特定DNA序列（DNA探针）是建立中草药鉴定基因芯片的关键。本文结合近年来中药及其它物种鉴别芯片研究进展总结了几种可用于中草药特异性DNA片段筛选的方法，并对这些方法的优势和不足做出评价。 　　1 利用现有药用植物基因资源筛选其特异性片段 首先，登录GeneBank网站，在核酸数据库中检索研究对象及其相关种属的基因序列(如植物的rRNA的ITS序列或微卫星序列或某种功能基因)，应用分析软件（如MacVector 6.5.1软件包中的Clustal W ALingnment程序），对这些序列进行对齐和分析，得到碱基对齐图和聚类分析的结果。然后根据对齐图找出具有高度多态性的区段，在这一区段用Primers程序设计引物并在相应区段结合Oligo 5.0程序找出所有可能的探针，经过筛选后在Genebank中进行Blast查询，筛选出特异性最好的片段作为探针使用。 这种方法简单、快捷，充分利用了现有的基因资源。目前很多微生物检测探针［11,12］及植物cDNA探针［13］都是根据已公开的基因序列设计的。然而，对于大多数药用植物种类，其遗传背景很不清楚。已注册的药用植物DNA 序列的数量相对于总的药用植物资源非常有限，而且这些已知序列中大多集中在少数植物种类［14］，所以，这种方法只适合于遗传背景比较清楚或已有相关序列发布的药用植物。 　　2 通过构建的DNA文库筛选 这种方法要求先构建DNA克隆文库或cDNA文库，然后从文库中随机选出若干克隆，将各克隆插入片段斑点印迹在杂交膜上(如硝酸纤维膜、尼龙膜)，用标记的本种基因组和其他种基因组的总DNA 为探针分别进行斑点杂交，选择与本种基因组杂交时杂交信号强，而与其他基因组杂交时无杂交信号的克隆，该克隆的插入序列即为本种基因组的特异序列。 Q. Cai. M.R. Bullen［15］从梯牧草属(Phleum)两个野生种P. alpinum和P. bertolonii的