天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bax、bcl2基因表达影响.docVIP

天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞凋亡及bax、bcl2基因表达影响 　 作者：黄益玲，黄利鸣，胡火军，黎家华, 张兆祥 【摘要】 目的 研究 天花粉蛋白对人宫颈癌HeLa细胞的诱导凋亡作用并探讨其对凋亡相关基因bax和bcl2表达的 影响 。 方法 不同浓度天花粉蛋白分别处理HeLa细胞24~72h后， MTT法检测细胞的生长活性, 显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期, Western Blot检测凋亡相关蛋白bax，bcl2的表达。结果显微镜下观察到细胞圆缩，染色体凝聚等凋亡细胞的形态学改变，流式细胞仪直方图上亦出现特征性的亚二倍体峰， 随着天花粉蛋白浓度的增加，bax基因的表达增加而bcl2的表达减少。结论天花粉蛋白对HeLa细胞的生长具有抑制作用，可诱导宫颈癌HeLa细胞发生凋亡，bcl2蛋白的减少与bax蛋白表达增多可能是HeLa细胞凋亡的机制之一。 【关键词】 天花粉蛋白；HeLa细胞；细胞凋亡 毕业论文 1材料和方法 毕业论文 1.1材料 1.1.1主要试剂MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）为Simga公司产品，蛋白酶K（ProtEinase K）为Merck 公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体、二抗HRP标记的羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG购于Santa Cruz Biotechnology公司，TCS购自上海金山制药厂。 毕业论文 1.1.2主要仪器及设备凝胶成像仪 The rmal imaging system FTI500为Pharmacia Biotech产品， 电转移槽为BioRad公司产品，STORM (Phospher Imager System)购自Dynamic molecular公司。 1.2方法 1.2.1细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5% ＣＯ2、37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10% FBS，0.1Ｕ/Ｌ青霉素, 0.1Ｕ/Ｌ链霉素, 取对数生长期细胞待用。 毕业论文 1.2.2MTT法测定TCS对HeLa细胞的生长抑制作用取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔细胞培养板中(细胞数为每孔2×104个)，12h后加入不同浓度的TCS，每个浓度设6个平行孔，继续培养24、48、72h，每孔加入5μg/ml MTT 溶液20μl继续培养4h后加入200μl DMSO溶解，测定570nm处光吸收值， 计算 细胞生长抑制率。 1.2.3细胞形态学观察将处于指数生长期的HeLa细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察HeLa细胞的形态改变。 1.2.4流式细胞仪DNA含量 分析 离心收集经TCS作用的细胞，以含0.2% FBS的PBS清洗后加入75%的冰冷乙醇固定, 在10000r/min条件下离心5min，去乙醇，以PBS洗涤2次，弃上清；用0.5ml PBS重新悬浮，然后加入等体积的细胞裂解缓冲液(含1％ NP40，50mmol/L TrisHCl，40mmol/L EDTA，pH值7.5)室温作用5min，离心后加入RNase(终浓度30μg/ml)置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1ml PI(终浓度50μg/ml)避光染色30min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。 1.2.5Western Blot检测凋亡相关蛋白bax及bcl2离心收获细胞，用预冷的PBS漂洗2遍，加入适量的细胞裂解液（临用前加入各种蛋白酶抑制剂）置冰上30min后，以13000r/min于4℃离心20min，调整蛋白含量, 加入等量2×SDSPAGE加样缓冲液，置95℃~100℃沸水中变性5min，行SDSPAGE垂直电泳, 电转PVDF膜，加50g/L脱脂奶粉于4℃冷库封闭过夜（或37℃封闭1h）， PBST洗膜后，分别加一抗bcl2、bax鼠抗人单克隆抗体、βactin羊抗鼠单克隆抗体(均为1∶1000稀释)37℃孵育1h，PBST洗膜；加HRP标记羊抗鼠IgG及兔抗羊IgG二抗，37℃孵育1h，PBST洗膜，等量的ECL反应液A和B混合后加至膜上1min，最后Χ片显影。 1.2.6统计学分析数据以±s表示， 用t检验分析差异显著性， 采用Pearson相关分析进行相关检验，运用SPSS10.0统计软件分析数据。 毕业论文 　 2结果 2．1TCS对HeLa细胞的生长抑制作用对照组HeLa细胞体外生长活跃, 实验组分别经20、40、80μg/ml