探析复方丹参注射液对氧化所致损伤血管内皮细胞保护作用.doc

探析复方丹参注射液对氧化所致损伤血管内皮细胞保护作用 　【关键词】 复方丹参注射液；,,血管内皮；,,扫描电镜 　　摘要：目的探讨复方丹参注射液对氧化所致损伤的血管内皮细胞的保护作用。方法采用脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein cells)，用倒置相差显微镜和扫描电镜观察各组内皮细胞（endothelial cell, EC）的形态学特点。分光光度计测定细胞上清液中丙二醛的含量。结果扫描电镜观察显示过氧化氢组EC皱缩变小，细胞表面干裂，表面微绒毛减少甚至消失，细胞间隙增宽，而经丹参预处理过的过氧化氢组细胞形态结构则明显改善。MDA含量测定表明过氧化氢组的MDA含量明显增高。相反，正常组和丹参组中MDA含量减少（Plt;0.01）。结论 复方丹参注射液通过其抗氧化作用，对氧化所引起的受损血管EC有保护作用。 　　关键词：复方丹参注射液； 血管内皮； 扫描电镜 　　心血管疾病是人类死亡的首要原因。在各种心脑血管疾病中，很多都是由动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）而引起。而许多研究表明血管内皮细胞（endothelial cell, EC）损伤是AS发生的始动环节［1］。因此保护血管内皮对防治AS具有重要意义。 本实验通过扫描电镜观察细胞的超微结构，用分光光度法检测MDA含量,以探讨丹参对受损伤的血管EC的保护作用，以及其抗AS的作用机理。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物与试剂复方丹参注射液（含丹参1 g/ml）为上海中西药液股份有限公司产品，批号021001；M199培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品；MDA试剂盒为北京邦定公司提供；扫描电镜为日本产品。 　　1.2 人脐静脉内皮细胞培养按Jaffe等［2,3］人的方法略加修改进行。在无菌条件下，取健康产妇的脐带， 灌注0.1%Ⅰ型胶原酶（collagenase-Ⅰ）10 ～15 ml，置37℃水浴中孵育15～20 min。1 000 r/min离心10 min，沉淀中加入含有20％FBS的完全M199培养液5 ml，充分混合制成细胞悬液，以（1.5~2.0）×104/cm2密度植入培养瓶中，置37℃，5％的CO2培养箱中培养，定期换液，待细胞长成融合状态后进行鉴定及进行实验。 　　1.3 实验分组及药物处理实验分为3个组：①正常组：加入含20％FBS的完全培养液培养；②H2O2组：首先加入含20％ FBS的完全培养液，待细胞基本融合时再加入终浓度为75 μmol/L的H2O2刺激4 h；③丹参组：加入含20％ FBS的完全培养液，培养24 h后，再加入终浓度分别为0.125，0.25 ，1.25 ， 2.5 mg/ml 和12.5 mg/ml的复方丹参注射液，继续培养24 h后再加入终浓度为75μmol/L的H2O2刺激4 h。 　　1.4 用倒置相差显微镜和扫描电镜观察细胞生长情况选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液接种于预置盖玻片的24孔板中，每孔加入（1～2）×105个HUVEC，放置于37℃，5％的 CO2培养箱内，含20％FBS的M199培养液中培养。待细胞生长呈亚融合状态后 各组按上述方法处理。取出玻片，放入3％戊二醛固定1 h，PBS洗3次，1％锇酸固定，PBS洗3次，梯度酒精脱水，用CO2临界点仪进行干燥，用离子溅射仪喷金，日立S3500N扫描电镜观察。 　　1.5 丙二醛（MDA）含量测定选用生长良好的HUVEC，制成细胞悬液，以浓度（1～2）×105/ml接种于24孔培养板。每组8个孔，设置7个组。细胞处理同上，终止培养并分别收集所有孔的上清液1 ml，置于20℃冰箱待测，然后按照北京邦定生物技术有限公司提供的试剂盒说明，用分光光度计检测MDA含量。 　　1.6 统计学处理所有实验数据用Excel统计软件进行统计分析。所有数值均以±s表示,组间比较用t检验进行统计学分析。 　　2 结果 　　2.1 内皮细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，正常组EC生长旺盛，呈上皮样贴壁生长，细胞呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层。在75 μmol/L的 H2O2作用4 h后，细胞间隙增大，胞体变小，细胞收缩变圆，失去细胞间连接，胞浆透明，少数细胞悬浮脱落；随着作用时间进一步延长，胞膜边缘不清楚，部分胞膜不完整，细胞出现空泡和颗粒变性，细胞脱落增多，到将近4 h的时候出现拉网现象。而经丹参预处理过的H2O2组EC形态与正常组相似，并且浓度越高越接近正常细胞组。扫描电镜可以观察到正常组(图1)EC呈圆形或梭形、多角形，表面微绒毛丰富，排列规则，有光泽，细胞膜完整，细胞间隙较小，细胞连接可见。H2O2组(图2)的EC皱缩变小，细胞表面干裂，胞膜表面有孔隙，有的呈现不规则锯齿状，表面微绒