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活化Chk1引起G2/M期阻滞在调节K562/A02细胞耐药中机制探析 　 作者：王海燕　张敏　邹萍　游泳　郭静明　唐晓琼　赵智刚 吴耀辉 【摘要】 　　本研究探讨活化的Chk1对白血病细胞周期及凋亡的影响，探究Chk1调控肿瘤细胞耐药的机制。以慢性粒细胞白血病细胞系K562及其耐药细胞系K562/A02（耐阿霉素）为研究对象,与阿霉素共孵育后，用流式细胞术检测细胞周期分布，RT-PCR检测Chk1mRNA表达水平，Western blot检测转染前后Chk1磷酸化水平；靶向Chk1shRNA抑制细胞内Chk1的表达后，用流式细胞术检测阿霉素作用后细胞的凋亡情况。结果表明：阿霉素致K562/A02细胞阻滞在G2/M期的细胞百分率为（54.12±0.57）％，显著高于K562细胞（36.99±1.28）%； Chk1mRNA表达水平在K562与K562/A02细胞间无显著差异； Chk1磷酸化水平在K562/A02细胞为0.79 ± 0.56，在K562细胞为0.27 ± 1.47，其差异有统计学意义。转染Chk1shRNA后，两株细胞的Chk1磷酸化水平显著下降。转染组K562、K562/A02细胞凋亡率分别是空载体转染组的1.30倍和3.84倍。结论： Chk1的活化水平调控着K562/A02细胞对阿霉素的敏感性。 【关键词】 Chk1　 G2/M期阻滞　 K562细胞　 K562/A02细胞　RNA干扰　 白血病细胞耐药 　　Mechanism of G2/M Blockage Triggered by Activated-Chk1 in Regulation of Drug-resistance in K562/A02 Cell Line 　　Key wordsChk1; G2/M arrest; K562 cell; K562/A02 cell line; RNA interference; leukemia cell drug-resistance 　　细胞周期G2/M检测点是监控细胞进入有丝分裂期的重要关卡。当放疗及化疗等因素致细胞DNA双链断裂（double strand breaks, DSB）后，三磷酸肌醇激酶的激酶(PIKK)家族成员ATR识别受损的DNA，将损伤信号通过其下游的因子如H2AX、 NBS1、BRCA1传递给细胞周期检测点激酶，从而使细胞周期阻滞在G2/M期，修复受损的DNA，使其继续进入细胞周期；如损伤广泛，则诱导凋亡。已有研究表明，化疗药物顺铂、丝裂霉素C引起的G2/M期阻滞延长与肿瘤细胞抗凋亡能力增强有关［1］；而且，原发耐药的肿瘤细胞本身具有阻滞在G2/M期的能力，且在此期延长［2］。这些结果表明，G2/M期检测点在肿瘤细胞耐药中发挥重要作用。细胞周期检测点激酶1（checkpoint kinase1, Chk1）是调控G2/M期检测点主要效应分子之一。我们前期的研究表明，应用RNA干扰技术抑制Chk1在K562/A02细胞中的表达，解除了G2/M期阻滞，增强了阿霉素诱导的细胞凋亡，这说明了Chk1参与了K562/A02细胞的耐药。但Chk1是如何影响肿瘤细胞的耐药特性尚不清楚，对此本研究作了进一步探讨。 　　材料和方法 　　材料和试剂 　　K562细胞系敏感株K562、多药耐药株K562/A02为本室保存株。携带绿色荧光蛋白（GFP）的RNAi真核表达载体pEGFP-H1和针对Chk1基因的短发夹状RNA（shRNA）pEGFP-H1/Chk1shRNA均由本室构建并经测序证实。RPMI 1640培养液、胎牛血清购自Gibco公司。逆转录试剂盒购自MBI公司，Taq DNA聚合酶购自北京天为时代生物公司。质粒小量柱式抽提试剂盒购自上海华顺生物公司。人β-actin和Chk1引物由上海生物工程公司合成。G418、碘化丙锭（PI）购自Sigma公司。兔抗人Chk1磷酸化抗体(S345)购自Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为北京中山生物工程公司产品。AnnexinV-cy5凋亡试剂盒购自Becton Dickinson公司。 　　方法 　　细胞培养K562、K562/A02于含10％胎牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml的RPMI 1640培养液中，在37℃、5％ CO2、水饱和湿度条件下培养。以常规方法诱导K562/A02细胞的耐药性［ 3］，并于实验前两周置于普通培养液进行培养。 　　细胞周期分析分别收集阿霉素(1 μg/ml)作用后6小时、24小时的K562、K562/A02两组细胞各1×106个，设未经药物处理的空白对照组，以冰冻的PBS洗2次，70%的乙醇4℃固定过夜，离心去上清，PBS洗2次后，加入0.3 ml 20 μg