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真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165构建及其在COS7细胞中表 　 作者：陈君 王胜军 仝佳 王海生 马斌 唐莉 胡正军 鲍俊峰 史烨 许化溪 【摘要】 目的： 构建含有人GITR胞外段的真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165，并检测其在真核细胞内的表达。方法： 将带有信号肽的GITR基因片段克隆至真核表达载体pDisplay,经酶切鉴定及测序分析，脂质体介导法转染COS7细胞，通过蛋白质印迹法检测其在COS7细胞内的表达水平。 结果： 所构建的真核表达质粒pDisplayhGITRaa1-165转染COS7细胞后,在其培养上清中检测到目的蛋白的表达。结论： 成功表达pDisplayhGITRaa1-165蛋白，为GITR的生物学功能研究奠定了基础。 【关键词】 GITR； COS7细胞; 真核表达 　　［Abstract］ Objective: To construct extracellular region of human GITR eukaryotic expression vector pDisplayhGITRaa1-165 and express hGITRaa1-165 protein in COS7 cells. Methods： The hGITRaa1-165 gene fragment containing a signal peptide was cloned into eukaryotic expression vector pDisplay. The constructed recombinant plasmid pDisplayhGITRaa1-165 was identified by restriction analysis and sequencing then transfected COS7 cells in the mediation of liposome. The recombination protein was analyzed by Western blot. Results： A eukaryotic expression vector pDisplayhGITRaa1-165 was successfully constructed. Western blot analysis proved the expression of hGITRaa1-165 in the supernatant of COS7 cells transfected with the recombinant plasmid. Conclusion： The pDisplayhGITRaa1-165 protein was successfully expressed in COS7 cells, providing research foundation for biology of GITR. 　　［Key words］ glucocorticoidinduced tumor necrosis factor; COS7 cells; eukaryotic expression 　　糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoidinduced tumor necrosis factor receptor，GITR）是1997年Nocentini等［1］在地塞米松诱导T细胞杂交瘤细胞中发现的膜蛋白受体，具有肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF）的特征，后被命名为TNFRSF18，属于I型跨膜蛋白。GITR在固有免疫和获得性免疫系统中均发挥重要作用，组成性表达于调节性T细胞表面，在静息期T细胞低表达，受到刺激后表达增加［2,3］。GITR的信号通路可增强抗肿瘤及抗病毒感染作用。GITR能触发效应性T细胞及调节性T细胞的活化［4-7］，调节性T细胞在免疫相关性疾病、肿瘤免疫和抗感染免疫等方面具有重要意义，目前有证据表明GITR与CD4+CD25+Treg 细胞的抑制功能有关。本实验构建pDisplayhGITRaa1-165的真核表达质粒，并在COS7细胞中表达目的蛋白，为进一步研究人GITR生物学作用奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　DMEM培养基购自美国Gibco公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，PCR纯化试剂盒、DNA Ligase、高GC 缓冲液Ⅰ，Ex TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性核酸内切酶、DL2000分子质量标准参照物均购自Takara Biotec公司，琼脂糖为上海意图公司分装产品, 梭华Sofa