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神经干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤活体示踪探究 　 作者：张立峰，茅祖斌，蒋赞利 【摘要】 目的：探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性及神经干细胞(NSCs)移植对大鼠脊髓损伤(SCI)后功能恢复的影响。方法：66只SD大鼠随机分为假损伤组（A组）、SCI对照组（B组）和细胞移植治疗组（C组）3组，应用已包被多聚左旋赖氨酸(PLL)的SPIO标记NSCs,对标记细胞进行普鲁士蓝染色，分别在细胞移植后第1、2、3、4、5周对各组动物进行BBB评分，细胞移植后1、3、5周行MRI检查。结果：(1)普鲁士蓝染色证实该方法标记NSCs的有效率为100%。（2）细胞移植后1～5周,B、C组动物运动功能均有不同程度恢复，但B组恢复较慢，BBB评分差异有统计学意义(P＜0.05)。（3）1.5 T MRI 检查 见移植处在T2WI序列呈低信号改变,第3周时低信号向损伤区扩大，第5周时可在损伤区见到低信号改变。结论：MR技术可以活体追踪干细胞，NSCs移植治疗SCI有利于大鼠后肢功能的恢复。 【关键词】 脊髓损伤； 神经干细胞移植； 磁共振成像； 大鼠 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI) 后自身的修复能力非常有限,死亡的神经元不能由自身产生的神经元或邻近的神经元来代替。近年来神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的研究改变了这一观点。NSCs是中枢神经系统中具有增殖和分化能力的一类细胞,是神经系统发育早期特定的细胞群体,它具备干细胞共有的特点，即能长久地保持增殖和分化能力［1］。随着分子影像学的发展,干细胞移植后的体内活体追踪是近期研究的一个突破点［2］。本研究利用超顺磁性氧化铁(super paramagnetic iron oxide,SPIO) 标记NSCs,对SCI大鼠进行细胞移植后的活体追踪,探索利用MR技术活体追踪干细胞的可行性以及NSCs移植对SCI大鼠后肢功能恢复的影响。 1 材料与方法 1.1 胎鼠来源NSCs的制备、培养与鉴定［3］ 取胚龄14 d SD大鼠胚胎的大脑脑室下区组织并吹打成单个细胞,以1×105ml－1种瓶,用DMEM/F12(1∶1)无血清培养基［内含bFGF 20 ng·ml－1、EGF 20 ng·ml－1、B27 20 ng·ml－1］培养。每6～7 d换液、传代1次。 对第2代细胞作免疫组化鉴定：取无血清培养基贴壁分化培养24 h的盖玻片1张,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脱脂奶粉封闭特异性抗原,室温孵育30 min,吸干残液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 ℃孵育过夜。第2天滴加FITC标记的羊抗小鼠IgG1二抗,室温孵育1 h,然后50%缓冲甘油封气,荧光显微镜下观察并摄像。 1.2 NSCs的标记和染色 细胞传至第3代,取适量已包被多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培养基中,37 ℃振荡60 min,使SPIO终浓度为25 μg·ml－1,将消化的细胞沉淀加入含SPIO的培养基中孵育12 h完成标记。 NSCs标记后普鲁士蓝染色:标记后的NSCs换成含10％血清的DMEM/F12培养液，置6孔板中培养7 d，去掉培养液，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗涤3遍,含2％亚铁氰化钾的6％盐酸溶液常温孵育30 min,显微镜下观察。 1.3 实验动物分组与SCI模型的制作 66只成年雄性SD大鼠,体重250～300 g,随机分为假损伤组(A组，6只)、SCI对照组(B组，30只)及细胞移植治疗组(C组，30只)3组。B、C两组参照改良的Allen重物打击法［4］制作大鼠脊髓背侧损伤模型：实验前大鼠禁食8 h，用戊巴比妥钠(30 g·L－1)按40 mg·kg－1腹腔注射麻醉,背部脱毛后俯卧位固定于动物手术台上,常规消毒,腰背部正中切口,逐层分开显露T8～T10椎板,行T9全椎板切除,显露硬脊膜,钳夹固定T8及T10棘突,用10.0 g的不锈钢棒(直径为2.5 mm)沿带有刻度的玻璃导管从25 mm高处垂直下落,打击在由塑料材料制成的底部呈凹面、直径为3 mm的撞杆上,后者将打击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开打击物,逐层缝合。模型成功的判断标准:打击后损伤处脊髓出血、水肿，大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。A组仅行T9全椎板切除术作对照。术后即刻腹腔注射5%葡萄糖盐水2 ml,以补充血容量。予青霉素钠盐5万U背外侧肌群肌肉注射预防感染,每天1次,持续3 d。注意保温,分笼饲养,自由取食,每天8：00及20：00行膀