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缺氧调控报告载体构建及鉴定 　 作者：杨洁，李占亭，杜德伟，柴青焕，王丽，张惠中，孙脊峰 【关键词】 荧光素酶 Construction and identification of hypoxia regulatory reporter vectors 　　【Abstract】 AIM: To construct the firefly luciferase reporter gene vectors regulated by hypoxia response promoters. METHODS: The oligonucleotides of hypoxia response element (HRE) and a mutation control were synthesized and cloned into pCIneo vectors to constrct HRE/CMV recombinant vectors. Then HRE/CMV promoters amplified by PCR were subcloned into pGL3Basic vectors. RESULTS: The integrity reporter vectors were verified by restriction enzyme digestion. Also, the sequences of the vectors were detected and aligned to the expected sequences. CONCLUSION: Luciferase reporter vectors regulated by HRE/CMV promoters were successfully constructed, which makes it possible to further investigate their potency of hypoxia regulation. 　　【Keywords】 transcription；regulation；hypoxia; response elements；luciferase；reporter gene 　　【摘要】 目的：构建能用来检测缺氧应答启动子转录调控作用的萤火虫荧光素酶报告载体. 方法：合成缺氧应答元件(HRE)的寡核苷酸序列及其突变对照，克隆入pCIneo，构建HRE/CMV重组载体. 然后采用PCR方法将HRE/CMV启动子定向亚克隆入pGL3Basic. 结果：酶切和测序鉴定分析，所克隆的基因产物酶切结果与预期值一致，序列无碱基的突变. 结论：成功构建了缺氧应答启动子的荧光素酶报告载体，为进一步研究其缺氧调控作用提供了条件. 　　【关键词】 转录；调控；缺氧;反应元件；荧光素酶；报告基因 　　0引言 　　目前已开发出多种报告载体用于研究启动子和/或增强子的调控活性［1-3］，如氯霉素乙酰转移酶报告载体，β半乳糖苷酶报告载体，β葡萄糖醛酸酶报告载体，碱性磷酸酶报告载体，绿色荧光蛋白报告载体以及荧光素酶报告载体. 其中荧光素酶报告载体以其检测迅速、敏感和重现性好，被广泛应用于启动子和增强子转录调控的研究［4］. 在基因调控机制研究中，应用报告载体对可能调控哺乳动物基因表达的基因元件进行定量分析是极为重要和必要的. 缺氧应答元件(hypoxia response element, HRE)是对缺氧可做出应激反应的缺氧反应基因内一段小于100 bp的单拷贝或多拷贝的顺式作用元件，能够与转录因子缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1, HIF1)结合，启动缺氧反应基因的转录，介导细胞对缺氧的反应［5-6］. 本文将各种不同缺氧应答基因的HRE与CMV启动子组合成缺氧应答启动子，构建其荧光素酶报告载体，快速对该遗传调控元件进行功能性分析. 　　1材料和方法 　　1.1材料Taq DNA聚合酶及KpnⅠ，HindⅢ限制性内切酶购自TaKaRa公司. 质粒小量制备与纯化试剂盒、PCR试剂购自天为时代公司. BglⅡ，SgfⅠ，IPpoⅠ限制性内切酶和pCIneo真核表达载体、pGL3Basic报告基因载体、JM109菌种由Promega公司提供. HREs的正向和反向单链由博雅公司合成（两端带有限制性内切酶的粘端切口）. 引物由奥科公司合成. 测序由基康公司完成. 其他试剂为进口或国产分析纯. 　　1.2方法 　　1.2.1HRE退火合成的HRE单链用去离子灭菌水稀释成3 g/L，退火反应体系：正向单链2 μL，反向单链2 μL，1×退火液将总体积补至50 μL（退火液的配方：醋酸钾0.98 g，HEPES 0.72 g，KOH 0