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羌活及宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系正交优化 　 作者：古松 蒋舜媛 唐学芳 孙辉 杨志荣 孙群 【摘要】 　　目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响，以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增（ISSR-PCR）最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素（Mg2+，dNTP，引物，Taq酶）在3个水平上进行优化实验，PCR结果用SPSS13.0统计软件分析，并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20 μl ISSR-PCR反应体系中，各组分的最适浓度为：2.0 mmol/L Mg2+，250 μmol/L dNTPs，0.50 μmol/L引物，1U Taq酶，40 ng DNA模板；模板DNA 40～90 ng，不同引物有不同的最佳退火温度，范围在48～52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。 【关键词】 羌活 宽叶羌活 简单重复序列区间扩增 正交实验设计 　　Abstract:Objective The optimal ISSR-PCR reaction system for Notopergium incisum Ting and N. forbesii Boissin was constructed by studying the influence of ISSR factors.MethodsThe orthogonal design with three levels of four factors (Taq DNA polymerase, Mg2+,dNTPs and primer) was used to optimize ISSRPCR amplification reaction system of N. incisum. and N. forbesii. The data of PCR results were analysed with SPSS software, and the different annealing temperatures were also studied by gradient PCR.ResultsThe optimal ISSR-PCR reaction system contained 2.0 mmol/L Mg2+, 1U Taq DNA polymerase，250μmol/L dNTPs, 0.50 μmol/L primer and 40 ng DNA template in the total volume of 20 μl. The Annealing temperature ranged from 48 to 52℃.ConclusionThe optimal ISSR-PCR reaction system provides the basis for further study on the genetic diversity among the populations of N. incisum. and N. forbesii. 　　Key words:Notopterygium incisum; N. forbesii; ISSR-PCR; Orthogonal design 　　羌活Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang和宽叶羌活N. forbesii Boissieu是我国特有的伞形科羌活属的多年生草本植物［1］，均为中药羌活的基源植物，以干燥根茎及根入药［2］，系传统中藏羌药的常用药材之一。主要分布在四川、青海、甘肃、西藏等省的高寒山区，历来依靠野生采挖。近年来的掠夺性采挖和生境破坏，致使各个道地产区面临资源枯竭和种质资源丧失的威胁，已被列入国家III级保护植物［3］，并进入中国濒危物种红色名录［4］。目前关于羌活在分子生物学方面的研究尚属空白。本次实验旨在建立一个适合于羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系，为下一步利用ISSR技术开展该类群的种质资源遗传多样性、遗传图谱构建和基因定位研究提供参考。ISSR（inter-simple sequence repeats , 简单重复序列区间扩增）是Zietkiewicz 等［5］1994年创建的新型分子标记技术，具有操作简单、成本低、快速灵敏、多态性高、所需DNA 量少以及无需预知研究对象的基因组序列等优点，同时也具有SSR的稳定性［6］。Jonsson等［7］的研究认为,在进行植物遗传多样性和系统发育的研究时,可优先考虑使用ISSR。国内近年来在药用植物方面也开始采用此方法。由于ISSR分子标记技术基于PCR反应，